微生物原生质体育种 第一节 微生物原生质体育种l 1953年，Weibull等人首先用溶菌酶溶解细胞壁获得了原生质体 l 1958年，Brenner等人提出了细菌原生质体的 3条标准，即没有细胞壁；失去细胞刚性，呈球形；对渗透压敏感 l 按照同样的标准，Eddy、Emerson、Bachmann等人用蜗牛酶配合其它条件分别从酵母菌或丝状真菌中释放出原生质体 l Douglas首先用溶菌酶从链霉菌菌丝中制备出原生质体 l 日本的岗西等人对链霉菌原生质体的形成和再生的条件进行了系统的研究，其结果至今仍为不少实验室所引用 l Landman等人以及Wyrick和Rogers对枯草杆菌的原生质体的形成和再生进行了研究l 所有这一切，都为原生质体融合技术的创立提供了必要的条件准备 微生物原生质体育种的方法l1.微生物原生质体再生育种l2.微生物原生质体诱变育种l3.微生物原生质体转化育种l4.微生物原生质体融合育种l5.其他微生物原生质体育种 一、微生物原生质体再生育种l 原生质体再生育种是微生物制备原生质体后直接再生，从再生的菌落中分离筛选变异菌株，最终得到优良性状提高的正变菌株。
l 高正变率的原因l1、本身较为敏感；l2、原生质体再生的细胞壁可能在组成与结构上都发生变化，甚至于产生可遗传的利于细胞代谢和产物外泌的变异；l3、制备原生质体的出发材料为对数生长期细胞；l4、原生质体再生材料无需经过遗传标记 l1. 原生质体再生育种的一般程序l 出发菌株的选择→菌种活化和预培养 →原生质体制备→原生质体再生→高产菌株分离（初筛）→复筛 →遗传稳定性鉴定→菌种特性及发酵特性研究 2. 原生质体再生育种实例l 如采用原生质体再生育种，使小单孢菌福堤霉素生产能力提高280%， 二、微生物原生质体诱变育种l常规诱变育种的缺点：l（1）单孢子材料，孢子壁厚，诱变剂渗入困难；l（2）与细胞代谢活跃程度关系极大l原生质体的优点l（1）直接与诱变剂接触l（2）制备原生质体的材料为对数生长期的细胞 （一）原生质体诱变育种方法l1、物理诱变剂诱变原生质体的一般程序l 对数生长期的菌体离心，洗涤→酶水解去壁，制成原生质体→离心，高渗溶液洗涤原生质体→稀释，放入无菌培养皿→紫外诱变→暗处理→移至再生培养基再生→分离优质菌株→突变体稳定性试验→突变体鉴定 2、化学诱变剂诱变原生质体的一般程序l 出发菌株培养和原生质体制备及再生→选择合适的化学诱变剂→诱变→离心弃诱变剂，洗涤→稀释，分离→再生培养→观察、筛选突变株→复筛→突变株鉴定 （二）原生质体诱变育种实例（二）原生质体诱变育种实例l1. 扩展青霉PF-868原生质体制备l 孢子玻璃纸培养至对数生长期，纤维素酶和蜗牛酶处理。
l2. 原生质体再生l 双层平板法l3. 原生质体诱变l 原生质体悬浮液调整至适当浓度，紫外线、He-Ne激光和60Co处理l4. 突变株鉴定 l三、微生物原生质体转化育种l 整条染色体DNA或片段DNA以及质粒DNA转化，促融合剂l四、微生物原生质体融合育种l 遗传性状不同的两个亲株原生质体融合l五、其他微生物原生质体育种 l 脂质体转移，原生质体转染等 第二节 微生物原生质体融合育种l 在1954年，Stahelin就曾用连续照像追踪了炭疽杆菌的原生质体融合 l 1985年，日本的冈田善雄发现灭活的仙台病毒可以诱发细胞融合，从而奠定了细胞融合的技术基础 l 目前普遍采用的化学融合方法是在1974年才建立起来的，当时，高国楠发现聚乙二醇(PEG)在Ca2＋存在下能促使植物原生质体融合，并显著提高融合频率 l 接着，聚乙二醇(PEG)的促融作用很快在微生物中得到证实，成功地实现了酵母菌、霉菌、放线菌和细菌等多种微生物在株内、株间、种间以及属间的融合，从而使原生质体融合技术在微生物方面形成了一个系统的实验体系l 目前，原生质体融合已成为微生物遗传育种的一种新工具。
原生质体育种优势：l（1）大幅度提高亲本之间重组频率l（2）扩大重组的亲本范围l（3）原生质体融合时亲本整套染色体参与交换，遗传物质转移和重组性状较多，集中双亲本优良性状机会更大 l原生质体融合育种一般包括如下步骤：l ① 标记菌株的筛选；l ② 原生质体的制备；l ③ 原生质体的再生；l ④ 原生质体的融合；l ⑤ 融合子的选择；l ⑥ 实用性菌株的筛选 一、直接亲本及其融合标记的选择l（1）正突变株l（2）亲本具有较大遗传差异l（3）营养缺陷和抗性标记l（4）热致死、孢子颜色，菌落形态l（5）荧光色素标记 二、原生质体制备与再生二、原生质体制备与再生l（一）原生质体制备l 原生质体的制备过程：分离→收集→纯化→活性鉴定→保存l 去壁方法：机械法、非酶分离法、酶法 l1、酶法分离原生质体的影响因素l（1）培养基组成：限制性培养基，甘氨酸l（2）菌体培养方式：平板玻璃纸法，振荡沉没法l（3）菌体菌龄l 丝状真菌：年轻的菌丝；酵母：对数期l（4）稳定剂l 高渗溶液：无机盐（氯化钠、氯化钾，氯化钙等）和有机物（蔗糖、甘露醇、山梨醇等）稳定剂的作用不仅能防止原生质体破裂，而且对提高酶的活性，促进酶和底物结合都有相当的优越性。
l（5）酶解前的预处理l 酵母和丝状真菌：巯基化合物；腐霉：TritonX-100或脂肪酶；酵母：EDTA；放线菌：甘氨酸l（6）酶系和酶的浓度l 溶菌酶(细菌、放线菌的肽聚糖)、蜗牛酶、纤维素酶、β-葡萄糖苷酶等（霉菌和酵母）l（7）酶的作用温度和作用pH值l 细菌高些，霉菌酵母低些，并考虑菌株的生长最适温度l（8）菌体密度：要控制好酶液中菌体密度l（9）酶解方式：通气和适当振荡 原生质体形成率的测定l（1） 细菌和酵母：l ① 血球计数板l l ② 蒸馏水处理，高渗再生培养基菌落计数法l（3） 霉菌和放线菌：l ① 蒸馏水处理，高渗再生培养基菌落计数法l ② 高渗培养基和普通培养分别培养法l l2、原生质体的鉴定l（1）低渗爆破法l 爆破彻底，没有残骸，破壁不完全则有残存细胞形态l（2）荧光染色法l 荧光增白剂（VBL）染色，洗涤后显微镜下观察，如发出红色光则为完全原生质体，如发出绿色光则表明还有细胞壁成分存在 l3、原生质体的收集和纯化（1）过滤法：丝状微生物2）密度梯度离心法：蔗糖或氯化铯。
3）界面法：两种液体密度有区别，原生质体就集中在两层液面交界处而得到纯化4）漂浮法：适用于细胞较大的微生物 4、原生质体的活力鉴定（1）荧光素双醋酸盐（FDA）染色法：活细胞发荧光2）酚藏花红染色法：活细胞染红色，死细胞为白色3）伊文斯蓝染色法：活细胞无色，死细胞为蓝色l5、保存 立即使用或低温冷藏数天可以采用液氮保藏，加入5%的二甲亚砜或甘油等做保护剂 （二）原生质体再生l 酶解去壁后得到的原生质体应具有再生能力，即能重建细胞壁，恢复细胞完整形态并能生长、分裂，这是原生质体融合育种的必要条件 l原生体再生分为三个阶段1. 大分子合成与原生质体生长2. 细胞壁合成与再生3. 分裂能力恢复并开始分裂繁殖成正常形态 l1、原生质体再生的影响因素①菌体生理状态：年青的强于年老的②稳定剂：高渗环境③酶浓度和酶作用时间：不宜过浓过长④再生培养基组成：需添加一些特殊成分⑤残存菌体的分离：会被未酶解的抑制生长⑥原生质体密度：先长的抑制后长的⑦排除培养基上的冷凝水：致使原生质体破裂⑧再生方法：一般采用双层平板法 2. 再生率的计算 l 再生菌数-剩余菌数原生质体再生率=-------------------------------×100%l 破壁前菌数-剩余菌数 l 各类微生物的再生频率是不相同的，细菌原生体再各类微生物的再生频率是不相同的，细菌原生体再生频率在生频率在90%以上，放线菌的频率为以上，放线菌的频率为50%-60%，真菌，真菌为为20%-70%。
三、原生质体融合protoplast fusion l（一）原生质体融合过程l 原生质体，PEG、 CaCl2、 MgCl2适温处理，去除PEG，分离培养l（二）融合的影响因素l 1. 融合剂：PEG、电场、激光l PEG适用的相对分子量为1000-6000，不同种类的微生物对PEG分子量的要求不同，放线菌：1000-1500；真菌：4000-6000；细菌 1500-6000PEG常用的浓度是30~50% l 2.温度：20~30℃，时间1min~1hl 3.亲株的亲和力和原生质体的活力l 4.无机离子： Ca2＋， Mg2＋促进融合；l 5.其他条件：细胞密度要在107~109个/mL 四、融合体再生l（一）融合体再生l 双亲融合后形成的融合体不等于重组体，以霉菌来说，可能是异核体或杂合二倍体或者重组体l 融合体的再生，包括融合体细胞壁合成、重建、融合体的再生l 融合原生质体再生的方法：l 1、 酵母、细菌：双层平板法l 2、放线菌、霉菌：双层平板法，也可以直接分离到高渗培养基平板上 （二）融合体的检出与分离l1、营养缺陷型标记：双亲带有不同营养缺陷型标记。
l2、抗药性：双亲具有不同的抗药性l3、灭活原生质体：融合前杀死一亲本l4、荧光染色法：双亲用不用的荧光色素染色标记l5、双亲对碳源利用不同：要结合其他特性l6、其他l 五、融合重组体检出l（一）重组体的检出和鉴别的方法l1. 直接法 2. 间接选择法 3. 钝化选择法l 指用灭活原生质体和具有活性的原生质体融合，灭活的原生质体和营养缺陷型菌株原生质体在基本培养基上都不能生长，只有融合体才能形成菌落l 原生质体灭活的方法可以用加热、紫外线照射或者药物处理等方法 （二）融合率l1. 直接法的融合率l 融合率（%）=基本培养基上再生的菌落数/完全培养基上再生的菌落数×100%l2. 间接法的融合率l 融合率（%）=重组体后代总数/所有后代总数×100% 不同微生物的融合率差别很大，如霉菌、放线菌的融不同微生物的融合率差别很大，如霉菌、放线菌的融合率为合率为0.1%-10%，细菌和酵母为，细菌和酵母为10-3-10-6异种间融合异种间融合率比同种间低得多，如霉菌种间融合率为率比同种间低得多，如霉菌种间融合率为0.1%~1%，酵，酵母、放线菌为母、放线菌为10-5-10-7。
（三）DNA含量及孢子形态测定l1. DNA的含量测定：测定孢子、菌丝或细胞的DNA含量，可以进一步帮助鉴别重组体l2.单倍化：必须连续几代自然分离、纯化，才能获得表型稳定的重组体，也可使用单倍化剂（重组剂）处理l3. 有关酶活性及孢子体积测定l4. 分子生物学方法： 核酸序列分析与比较 六、原生质体融合的应用l1、提高产量或质量，合成新物质l2、改良菌种遗传特性l3、优化菌种发酵特性l4、质粒转移l5、原生质体与细胞核融合l6、进行遗传分析 第八节 细菌原生质体融合育种l一、概述l二、细菌原生质融合育种一般程序l三、细菌原生质融合育种技术l（一）培养基与溶液l 常用培养基、高渗溶液l（二）细菌原生质融合育种l 提高细菌原生质体制备和再生率的方法l 预处理；溶菌酶；细菌生理状态；培养基组成与培养条件l 建立最佳融合体系l 重组子分离模型 l（三）操作方法1.细菌原生质体的制备方法2.细菌原生质体制备率3.细菌原生质体再生4.原生质体融合5.融合体分离与检出6.重组体分析和鉴定 第九节 放线菌原生质体融合育种l一、放线菌细胞壁组成和结构及水解l（一）放线菌细胞壁组成和结构l（二）细胞壁水解l水解酶；酶解环境条件l二、放线菌原生质体融合育种l（一）培养基与溶液l（二）菌体培养及预处理l液体培养法；玻璃纸培养法 第十节第十节 酵母菌原生质体融合育种酵母菌原生质体融合育种l一、酵母菌细胞壁结构和遗传标记l二、酵母菌原生质体融合技术l（一）出发亲本菌株的筛选及单倍体分离l（二）酵母菌原生质体融合常用培养基与溶液l（三）原生质体制备l（四）原生质体再生l（五）酵母菌原生质体融合l（六）融合重组体鉴定与遗传分析l 细胞体积测定；融合子核DNA含量的测定及核型的观察；同工酶分析；重组体交配型鉴定 l（三）原生质体制备l（四）原生质体再生l（五）原生质体融合与再生lPEG诱导融合法l电融合法l融合体的检出 。