氢化酶及其最新研究进展1 氢化酶的定义及分类1.1氢化酶的定义微生物的能量代谢过程中常伴随着质子还原和氢气的氧化过程，经过研究人们发现，在这些微生物体内存在一种蛋白酶，能够催化氢气和质子之间可逆的氧化还原过程，这种酶被称为氢化酶(Hydrogenases,简称为Hases);也称为氢酶，是存在于微生物体内可逆催化氢气氧化还原反应(反应为H22H++2e-)的一类生物酶[1]1.2氢化酶的分类目前人类已经发现并且提纯了多种氢化酶，各种氢化酶在它们的蛋白结构和所利用的电子载体的种类（如铁氧化还原蛋白、红素氧化蛋白等）上有着很大的差异[1]据氢化酶活性中心所含金属原子的不同，氢化酶主要分为三种类型[2]：(1)[FeFe]氢化酶,存在于细菌和低等真核细胞中，如藻类和原生生物，可以可逆地催化质子和氢气之间氧化还原过程，但一般认为其主要功能是催化质子还原产氢，对氧气较为敏感[2]2)[NiFe]氢化酶，存在于大多数细菌，许多古生菌和藻氰菌中，最初的研究认为这种酶的主要功能是催化氢气氧化，但后来发现有些[NiFe]氢化酶也是良好的产氢催化剂；这类酶中有些含有Se，被称为[NiFeSe]氢化酶[2]。
3)[Fe]氢化酶，这类酶只存在于产甲烷的古生菌中，酶中不含Ni原子和[FeS]簇，它不能直接催化氢气和质子之间的氧化还原过程，它的功能是在氢气存在下可逆地催化methenyl-H4MPT+还原产生methene-H4MPT和质子，这一反应过程是微生物体内二氧化碳转化成甲烷的一个中间步骤[2]上述三种酶中，[FeFe]氢化酶的催化效率最高，约为其他两种的10-100倍[1][NiFe]氢化酶在自然界中含量最丰富，人们对其研究最为广泛和深入而根据氢化酶的催化特性，可将氢化酶分为吸氢酶放氢酶和双向氢酶等类型[2]2 氢化酶的活性中心2.1 [NiFe]氢化酶的活性中心结构[3]1996年，Voldeba等人对D.gigas菌中[NiFe]氢化酶做了高分辨率的晶体解析，活性中心的结构基本确定：NiFe氢化酶活性中心是一个Ni-Fe异双核结构，与Ni配位的为四个半胱氨酸，其中两个通过半胱氨酸的S原子作为端基配位，另外两个则通过半胱氨酸的S原子与Fe相连，Fe周围不再有其他蛋白配体，而是有一个CO和两个CN-作为端基配位，Ni-Fe间还有一个含氧配体参与成桥这样Ni为五配位的四方锥构型，Fe为六配位的变形八面体，两个S与两个CN-在赤道平面上，CO与O处于轴向，Fe周围的强场可导致Fe保持低自旋。
图2.1不同氧化态的[NiFe]氢化酶的活性中心结构2.2 [FeFe]氢化酶的活性中心结构[3]1998年，Peters 课题组发表了巴氏梭菌 [FeFe]氢化酶(简称CpI)的晶体结构[8]；1999年，Fontecilla-Camps课题组发表了脱硫脱硫弧菌[FeFe]氢化酶(简称DdH)的晶体结构研究发现，[FeFe]氢化酶的活性中心，也叫氢簇，深深嵌入蛋白质内，在这两种氢化酶的蛋白质表面和氢簇之间都有一条疏水通道，由于氢化酶 CpI(催化质子产氢)和DdH(催化氢气氧化)具有不同的催化功能，这条疏水通道被认为是氢气自活性中心传出或氢气由蛋白质外到达活性中心的重要通道通过单晶解析,光谱和理论计算等研究，基本确定了[FeFe]氢化酶的基本结构特征：它的活性中心是由一个[4Fe4S]立方烷和一个[2Fe2S]子簇组成，这两个子簇之间是通过[4Fe4S]的一个半胱氨酸残基的硫原子与[2Fe2S]的一个Fe相连，[4Fe4S]立方烷通过另外三个半胱氨酸与蛋白质骨架相连两个Fe中心通过一个双硫醇负离子配体桥连，两个双硫间的桥头原子可能为CH2，O或NH此外，[2Fe2S]子簇中的两个Fe中心都含有不寻常的双原子非蛋白配体CO和CN-，而这两种配体对生物体有毒，在生物酶中较为罕见。
对DdH活性中心的结构研究表明，它可以氧化态(Hox)和还原态(Hred)两种形式存在，其活性中心结构见图2.2图1.2 DdH 氢化酶活性中心的结构CpI和DdH非常相似，但仍然有区别在CpI氢化酶活性中心的Fed中心不再有空的配位点，而是有一个H2O配体当CpI氢化酶的氧化态Hox处于高浓度的CO气氛时，会产生CO抑制态HoxCO, 此时氧化态桥羰基反位的水分子或空配位点被CO配体所取代, 这表明此配位点是氢化酶发生催化作用的活性位点[11]CpI氢化酶活性中心的结构见图2.3图2.3 CpI 氢化酶活性中心的结构3 氢化酶及其模拟物的研究进展3.1 [FeFe]氢化酶及其模拟物研究进展3.1.1二茂铁基[FeFe]氢化酶 James M等[4]报道了具有氧化还原活性的适当修饰的二茂铁基配体Cp*Fe(C5Me4CH2PEt2)(FcP *)，在温和电位下的氧化复制了铁氧还蛋白的功能，与大多数二茂铁基配体的对比，它可能是一种有用的铁氧还蛋白辅酶因子的类似物具体的模型是Fe2[(SCH2)2NBn](CO)3(FcP *)(dppv) (1),其中包含三个活性部位的功能组件:一个有反应活性的双铁中心，一个胺作质子传递，并且第一次使用了单电子氧化还原模型。
对于氢气和一氧化碳，合成的氧化还原辅酶因子[1]2+展现了特殊的反应活性在多余的氧化剂和基质的存在下，[1]2+对氢气的氧化有催化作用FcP *和(1)的结构如图3.1.1 图3.1.1 FcP *和(1)的结构 上述实验支持了H2活化的概念，H2被混合化合价的双铁中心模型氧化得益于温和的分子内的氧化剂的存在，这个功能在[FeFe]氢化酶中由[4Fe–4S]簇提供表明适当修饰的二茂铁可以复制[4Fe–4S]簇的作用，却没它们复杂能量转换中的质子偶合电子转移（PCET）格外重要，FcP*的低氧化还原电位的性质可能适用于其他生物酶模拟物3.1.2 [FeFe]氢化酶光催化产氢 2011年，Wang等[5]报道了一种低廉、稳定、有效的光催化体系(2)，人造[FeFe]氢化酶类似物在水溶液中能够催化H+转化为H2与当时最先进的催化体系相比，该体系TON值505、TOF为50 h-1很有竞争力催化剂体系2如图3.1.2，[FeFe]模拟物活性中心没有CN-，以增强催化剂在水中的稳定性；3-巯基丙酸稳定的纳米晶体量子点CdTe(MPA-CdTe)作为光敏剂；H2A作为电子牺牲体图3.1.2 天然[FeFe]氢化酶和人造[FeFe]模拟物的结构尽管天然氢化酶已经应用在一些半导体材料上面，本文是第一例合成的[FeFe] 氢化酶模拟物与纳米晶体量子点结合并在无任何外部操作情况下应用于光驱动产氢。
合成的[FeFe]氢化酶模拟物稳定性一般较差，1小时光照下部分解就可以作为光催化产氢的一种有效的催化剂本文中，催化效率和稳定性表明2和MPA-CdTe物种在整个光催化反应过程中可以有效再生Wang等[6]报道了利用两亲性聚合物胶束作为微反应器来在水中构建一个疏水性的[FeFe]氢化酶模拟物表明局部浓度的提高、模拟物和光敏剂之间的强相互作用以及微反应器导致的水介导的快质子迁移都会显著提高水中光催化制氢的效率3.1.3 特定蛋白支架[FeFe]氢化酶是在各种细菌和藻类的微生物能量代谢中所涉及的金属酶，具有极强的催化性能，如果能将其转化成生成和利用燃料电池中的氢的一种手段的话将会极为有用在这些酶中，催化发生在一个独特的“二铁”中心，它包含一个桥联二巯基配体、三个CO配体和两个CN-配体G. Berggren等[7]发现，这一“二铁”中心的三个合成模仿物可以被加载到[FeFe]氢化酶成熟蛋白HydF上，然后转移给藻类变体apo-HydA1HydA1的充分活化只有通过包含具有一个氮杂丙烷桥桥的模仿物的HydF杂合蛋白才能实现，从而证实了这一配体在原始 [FeFe]氢化酶的活性点上的存在这是采用一个特定蛋白支架与活性点合成类似物的组合来实现受控金属酶活化的第一个例子。
3.2 [NiFe]氢化酶及其模拟物研究进展3.2.1 [NiFe]氢化酶活性中心影响因素 Katharina Weber等[8]报道了两种[NiFe]氢化酶活性中心结构模拟物1和[1H][BF4]（图3.2.1），二者都是功能化的酶活性结构模拟物质子化作用发生在硫醇盐末端和镍原子连接的硫原子上质子化的半胱氨酸末端的催化中间体猜测是最初的蛋白质，但是尚未得到实验证实 [1H][BF4]是含质子化Cys−SH的[NiFe]中间体中第一个双核的[NiFe]模型化合物图3.2.1 [NiFe]活性中心结构模拟物1和[1H][BF4]实验结果清楚地表明，质子化作用对铁中心电子结构有显著的影响，尽管反应发生在Ni的位置；DFT计算结果表明金属离子间有键的相互作用存在，并与酶有关；电化学实验表明，1和[1H][BF4]对质子惰性溶剂中电催化的质子还原有活性 David Schilter等[9]合成了一系列混合化合价的[NiFe]二巯基活性中心模型通过基础结构和光谱数据，[(e)-Ni(xdt)Fe(CO)2L]+型的复合物被描述为Ni(II)Fe(I)混合化合价物种；与之对比，Ni(I)Fe(II) 核代表 [NiFe]氢化酶中的Ni-L状态，并且可能与 [FeFe]氢化酶氧化态中Fe(I)Fe(II)更相关。
晶体学数据表明，在Ni(I)Fe(I)前驱体氧化中发生了巨大的几何变化，猜测是Ni(I)Fe(II)复合物可能不只需要末端配体的变化，同时也要考虑Ni配位环境的控制以便更好的匹配酶几何结构的变化3.2.2 [NiFe]氢化酶光催化产氢 Seiji Ogo等[10]报道了一个[NiFe]氢化酶的功能化的[NiFe]为中心的模拟物（图3.2.2），其在碱性条件下可以成功裂解H2生成氢化物，并且在酸性条件下可以催化质子产生氢气完成了对氢化酶功能模拟的完善这个复合体能极性分解氢以组建氢复合物，通过氢离子或电子转移做还原性底物晶体结构表明氢配体主要是与铁中心相连接配体氢的性质通过与强酸反应放出氢气的活性表明图3.2.2 [NiFe]复合物及其氢离子或电子转移过程Peter A.等[11]首次报道了基于[NiFe]氢化酶模拟物的光致产氢体系，利用Re和Ru的金属配合物作为光敏剂在有机体系中研究了催化产氢循环的机理（图3.2.3）图3.2.3 (a)为不活跃状态的[NiFe]氢化酶;(b)为1([Ni(L)Fe2(Co)6] ,L2-=(CH3C6H3S2)2(CH2)3);(c)为可能的光催化电子转移机理参考文献[1]张岩,李秀艳.氢化酶的结构、催化机理及其应用[J].上海化工,2011,03:6-9.[2]杜明,任南琪,张璐,许继飞,邱颉.氢化酶结构研究进展[J].生物信息学,2009,04:323-325.[3]孙晓静.氢化酶活性中心模型物的合成、表征及电化学研究[D].南开大学,2012.[4]Camara, J. M. and T. B. Rauchfuss (2012). "Combining acid-base, redox and ubstrate binding functionalities to give a complete model for the FeFe -hydrogenase." Nature Chemistry 4(1): 26-30.[5]Wang, F., W.-G. Wang, et al. (2011). "A Highly Efficient Photocatalytic System for Hydrogen Production by a Robust Hydr。