酵母RNA的提取 1 实验目的 1 掌握稀碱法提取RNA的原理和方法2 学习和了解其它提取RNA的方法和原理 3 实验原理 一般的生物细胞中同时含有DNA和RNA 在酵母中RNA比DNA的含量高得多 RNA 2 67 10 0 DNA则少于2 O 03 O 516 在实验室常用酵母作为RNA提取的材料 若要制备具有生物活性的RNA 可采用苯酚法 去污剂法和盐酸胍法等 最常用的是苯酚法提取RNA 若对生物活性没有要求 则可使用浓盐法 稀碱法等 工业中用稀碱法或浓盐法 主要用于制备核苷酸的原料 苯酚法 组织匀浆用苯酚处理并离心后 RNA即溶于上层被酚饱和的水相中 DNA和蛋白质则留在酚层中 向水层加入乙醇后 RNA即以白色絮状沉淀析出 此法能较好地除去DNA和蛋白质 浓盐法 在加热的条件下 利用高浓度的盐改变细胞膜的透性 使RNA释放出来 再利用等电点 pH为2 0 2 5 沉淀 此法易掌握 产品颜色较好 盐浓度需要控制 太低 RNA不易从细胞中释放出来 太高 细胞急剧收缩不利于抽提 一般80 120g L为宜 稀碱法 利用细胞壁在稀碱条件下溶解 使RNA释放出来 这种方法提取时间短 但RNA在稀碱条件下不稳定 容易被碱分解 本实验采用的稀碱 既可加速细胞的破裂 又可增大RNA的溶解度 当碱被中和后 可用乙醇 或者异丙醇 将RNA沉淀 或用等电点沉淀RNA 应严格控制pH 缓慢调 此为RNA的粗品 核糖核酸含有核糖 嘌呤碱 嘧啶碱和磷酸各组分 加硫酸煮沸可使其水解 从水解液中可以测出上述组分的存在 1 嘌呤碱与硝酸银作用产生白色的嘌呤银化合物沉淀 2 磷酸与钼酸铵试剂作用产生黄色的磷钼酸铵沉淀 NH4 3PO4 12MoO3 有还原剂存在时 形成蓝色钼蓝 NH4 MoO4 H2SO4H2MoO4 NH4 2SO4H3PO4 12H2MoO4H3P Mo3O10 4 12H2OH3P Mo3O10 4Mo2O3 MoO3 钼蓝 还原产物钼蓝在波长660nm测定吸光值 当无机磷含量在1 25 g范围内 光吸收和含磷量成正比 RNA的含磷量为9 5 即1 gRNA磷相当于10 5 gRNA DNA的含磷量平均为9 9 3 地衣酚 苔黑酚 显色法 RNA与酸共热时降解 形成戊糖 继而形成糠醛 呋喃甲醛 糠醛与地衣酚 3 5 二羟基甲苯 反应 形成鲜绿色复合物 可用比色法测定 当核糖核酸浓度在10 100 g ml范围内 其浓度与吸光度成线性关系需要FeCl3或Cu2 作催化剂 4 实验操作 一 RNA的提取 1 称5g干酵母粉于150ml三角烧瓶中 加25mlO 2 的NaOH 沸水浴中搅拌提取20min 冷却后滴加乙酸使其略偏酸性 pH约5 6 目的是去除蛋白质 2 离心 4000r min 13min 去除沉淀 上清液冰浴 3 向上清液中加入20ml 约上清液的两倍体积 95 乙醇 稍搅拌后静置 冰浴约10min 待完全沉淀后离心 4000r min 15min 去上清液 4 沉淀用95 乙醇洗两次 如沉淀浮起需再次离心 每次约10mL 用乙醚洗两次 每次10mL 目的是去除脂溶性物质和水 乙醚的沸点比乙醇的低 所以最后加乙醚有利于沉淀的干燥 二 RNA的鉴定取沉淀约1g 加10ml10 H2SO4 沸水浴中加热30min 5 嘌呤碱取水解液2mL加入2mL浓氨水 然后加入约1mL5 硝酸银溶液 观察有无嘌呤碱的银化合物沉淀 慢慢加入嘌呤碱时 沉淀上浮 摇匀 沉淀下沉 6 核糖取1支试管加入水解液0 5mL 1mL苔黑酚三氯化铁浓盐酸溶液 放沸水浴中2分钟 注意溶液是否变成绿色 说明核糖的存在 时间久了会有黑色沉淀 是浓度高 产物结晶出来了 5 注意事项 避开磷酸二酯酶和磷酸单酯酶作用的温度范围20 70 防止RNA降解 在90 100 条件下加热可使蛋白质变性 破坏磷酸二酯酶和磷酸单酯酶 有利于RNA的提取 在调pH值时 一定要缓慢小心 且要在低温下进行 在洗涤时 要用乙醇洗涤 且不可用水洗 否则将导致RNA部分溶解而造成损失 降低RNA提取率 提取RNA时必须用沸水浴 并经常搅拌 NaOH必须实现预热 用乙酸调pH5 6必须有 目的可以除去一些杂质 最后过滤前必须将乙醇沥干 不能带水 否则RNA会粘在滤纸上 无法取下 也可以采用离心的方法 所得RNA粗品应是浅黄色粉末状 6 原始数据 记录实验过程中的现象 7 讨论 7 1 用稀碱法提取酵母RNA的过程中需注意什么 7 2 鉴定RNA的原理 。