2.1 固相析出分别技术通过参加某种试剂或转变溶液条件，使生化产物以固体形式从溶液中沉降析出的分别纯化技术称为固相析出分别技术依据析出物的形态不同分为结晶法〔结晶析出〕和沉淀法〔无定形固体析出〕第一节 沉淀分别技术 沉淀法也称溶解度法，其纯化生物大分子的原理是依据物质的构造差异〔如蛋白质分子外表疏水基团和亲水基团比例的差异〕来转变溶液的某些性质〔如pH 值、极性、离子强度、金属离子等〕，使抽提液中有效成份的溶解度发生变化，从而到达从抽提液中分别有效成份的目的一、盐析沉淀法1. 盐析的原理定义：一般在低盐浓度的状况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的上升而增加，这种现象称为盐 溶；而当盐浓度上升到肯定程度后，蛋白质的溶解度又随着盐浓度的上升而降低，结果使蛋白质沉淀析出， 这种现象称为盐析作用在同一浓度的盐溶液中，不同蛋白质的溶解度不同，借此可到达彼此分别的目的原理：盐浓度增高到肯定数值后，水活性降低，导致蛋白质分子外表电荷渐渐被中和，水化膜相继被破坏， 最终引起蛋白质分子间相互聚拢并从溶液中析出盐能够转变蛋白质的溶解度，蛋白质的溶解度与溶液中离子强度有亲热关系两者的关系可用下式表示： lg〔S/So 〕= -KsI S 为蛋白质在离子强度为 I 时的溶解度(g/L)；So 为蛋白质在离子强度为 0 时的溶解度；Ks 为盐析常数；I 为离子强度。
在温度肯定的条件下，某一蛋白质在某一 pH 值的水溶液中的溶解度为一常数So故上式可 改写为：lgS = lgSo – KsI = β – KsI β =lgSo 为一常数 β 值主要取决于蛋白质的性质，也与溶液的温度和pH 值有关 ；盐析常数 Ks 主要与盐的性质(离子价数、平均半径等)和蛋白质的构造有关，Ks 越大， 盐析效果越好所以对某一蛋白质来说，在温度和 pH 值等盐析条件确定(即β 确定)，所承受的盐确定(即 Ks 确定)以后，蛋白质的溶解度打算于离子强度Ｉ,Ｉ可用下式计算： Ｉ = 1/2 ∑m Z 2i im :溶液中离子的摩尔浓度 Z ：离子的价数对于多种蛋白质或酶的混合液，可承受分段盐析法进展分别纯化i i2. 盐的选择：蛋白质的盐析通常承受中性盐，如硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠、磷酸钠等，其中应用最广的是硫酸铵 硫酸铵是一中性盐，对蛋白质有相当好的安定作用又由于其离子容积较大，吸走水分子的力量也大，成为有效的盐析工具硫酸铵在水中的溶解度大而温度的影响小 ( 25 ℃时溶解度为 4.1mo l/L ，即 767g/L;0℃时溶解度为3.7mol/L，即 697g/L)，而且价廉易得，不易引起蛋白质变性，分别效果比其他盐好。
但是用硫酸铵盐析时，缓冲力量较差，而且铵离子会干扰蛋白氮的测定，故有时也要用其他盐来进展盐析磷酸钾和硫酸钠的盐析系数 Ks 较大，但由于在较低温度下的溶解度太低,受温度影响大，故应用不广泛3.硫酸铵浓度的计算与调整方法 :通常硫酸铵的添加以百分饱和度來表示 (不是浓度百分比)，例如大局部蛋白质可在 80% 硫酸铵饱和度下沉淀由于硫酸铵参加的体积很大，会转变最终的总体积，很难由浓度百分比來計算，因此使用百分饱和度作为沉淀蛋白质的度量用硫酸铵进展盐析时，蛋白质溶液中硫酸铵浓度的调整方法主要有二种 ：〔1〕参加饱和溶液法 要求：蛋白质溶液体积不大，所需调整的硫酸铵浓度不高V= V (S -S )/〔1-S 〕 V:所需加进的饱和硫酸铵溶液的体积；V :原溶液体积；S ：所需到达的硫酸铵0 2 1 2 0 2饱和度；S :原溶液的硫酸铵饱和度1饱和硫酸铵的配制方法：在肯定量的水中参加过量的硫酸铵，加热至 50－60℃，趁热滤去沉淀，再在 0℃ 或室温平衡 1－2 天，有固体析出时达 100％饱和度2) 参加固体盐法要求：饱和度高，不增大溶液体积t=G(S -S )/〔1-AS 〕S2，S1:分别代表所需到达的硫酸铵饱和度和原溶液的硫酸铵饱和度；t：将 1L S12 1 2饱和度的溶液提高到 S2 饱和度时所需加进的硫酸铵克数；G,A：常数，与温度有关。
实际使用时，t 可直接查表得到〔留意：0℃，25℃两张表，室温用 25℃〕4. 影响蛋白质盐析的因素：（1） 蛋白质浓度蛋白质浓度高时，欲分别的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质一起沉淀出来〔共沉现象〕因此在盐析前要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在 25－30g/L2） 离子强度和离子类型的影响a.离子强度增加，溶解度下降，盐析易发生 b.不同蛋白质盐析时所需离子强度不同，可承受分步盐析，通过逐步增加离子强度，使不同蛋白分步沉淀出来 c.离子强度一样时，高价离子，半径小的离子盐析力强3〕pH 的影响 大多数蛋白质在等点电时，在盐溶液中的溶解度最低所以盐析时溶液pH 值调到等电点效果最好〔4〕温度的影响 a.在低离子强度或纯水中，温度上升，溶解度增加； b.在高盐溶液中，温度上升，溶解度降低一般在室温下进展盐析;温度敏感的蛋白质在低温 4℃进展;也有个别酶在低温时失活，高温有活性,如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白在 25℃比 0℃时溶解度低，更简洁盐析实际使用：制备初期：pH ，温度肯定，转变盐浓度〔离子强度〕〔Ks 分段盐析〕；纯化，结晶：离子强度肯定，转变 pH，温度〔β分段盐析〕lgS = lgSo – KsI = β – KsI5. 盐析时的留意事项 ：〔1〕添加的硫酸铵的纯度要高，添加后，要放30min 以上使其充分溶解，且要不断搅拌，防止局部过浓，发生共沉淀；〔2〕同一溶液中欲分别几种蛋白质时，可承受分段盐析的方法。
盐析通常与等电点沉淀法协作使用〔3〕选择好温度，一般在室温下进展；〔4〕蛋白浓度不易过高，一般 25－ 30g/L；低浓度盐析，可用离心分别；高浓度盐析〔70－80％〕，用过滤〔由于粘度大，离心操作慢〕；盐析沉淀得到的蛋白质含量较高，纯品需经脱盐处理，如透析，凝胶过滤等二、有机溶剂沉淀法〔一〕作用机理：〔1〕降低水溶液的介电常数，使溶质溶解度降低； 〔2〕破坏大分子四周水膜，使溶解度降低利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度不同而使蛋白质分别的方法，称为有机溶剂沉淀法常常使用的有机溶剂是乙醇和丙酮优点：比盐析法析出的沉淀简洁过滤或离心分别，区分力比盐析法好，溶剂也简洁除去缺点： 有机溶剂沉淀法易使蛋白质和酶变性，所以操作必需在低温条件下进展蛋白质和酶沉淀分别后， 应马上用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂浓度，避开变性本钱较高，有肯定的危急性 中性盐可削减有机溶剂引起的蛋白质变性，提高分别效果，一般添加 0.05mol/L 的中性盐 由于中性盐会增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度，故中性盐不宜添加太多 有机溶剂沉淀法一般与等电点沉淀法联合使用即操作时溶液的 pH 值应掌握在欲分别蛋白质的等电点四周。
留意事项：〔1〕 低温操作〔2〕样品浓度过大，易变性，共沉淀作用大，分别效果差；过小，易产生变性，回收率低〔3〕样品稳定构造范围内，选择溶解度最低处的 pH，即与等电点共沉淀结合使用〔4〕 留意离子强度，离子种类的影响〔二〕有机溶剂的选择和浓度的计算用于生化制备的有机溶剂的选择首先是要能与水互溶沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮为了获得沉淀而不着重于进展分别，可用溶液体积的倍数：如参加一倍、二倍、三倍原溶液体积的有机溶剂， 来进展有机溶剂沉淀〔三〕有机溶剂沉淀的影响因素 1 温度：多数生物大分子如蛋白质、酶和核酸在有机溶剂中对温度特别敏感，温度稍高就会引起变性，且有机溶剂与水混合时产生放热反响，因此必需预冷，操作要在冰盐浴中进展，参加有机溶剂时必需缓慢且不断搅拌以免局部过浓 一般规律是温度越低，得到的蛋白质活性越高 2.样品浓度：低浓度样品回收率低，要使用比例更大的有机溶剂进展沉淀高浓度样品，可以节约有机溶剂，削减变性的危急，但杂蛋白的共沉淀作用大通常使用5mg/mL～20mg/mL 的蛋白质初浓度为宜3 pH 值：选择在样品稳定的pH 值范围内，通常是选在等电点四周，从而提高此沉淀法的区分力量。
4 离子强度：盐浓度太大或太小都有不利影响，通常盐浓度以不超过 5％为宜，使用乙醇的量也以不超过原蛋白质水溶液的２倍体积为宜，少量的中性盐对蛋白质变性有良好的保护作用，但盐浓度过高会增加蛋白质在水中的溶解度，降低了沉淀效果，通常是在低浓度缓冲液中沉淀蛋白质5.其他金属离子 一些金属离子如 Ca2+,Zn2+等可与某些成阴离子状态的蛋白质形成复合物，从而降低溶解度而不影响其活性，有利于沉淀形成，并降低溶剂用量留意：沉淀所得的固体样品，假设不是马上溶解进展下一步的分别，则应尽可能抽干沉淀，削减其中有机溶剂的含量，如假设必要可以装透析袋透析脱有机溶剂，以免影响样品的生物活性三、其他沉淀法〔一〕等电沉淀法：利用蛋白质在等电点时溶解度最低以及不同的蛋白质具有不同等电点一这特性，对蛋白质进展分别纯化的方法称为等电点沉淀法在等电点时，蛋白质分子的净电荷为零，消退了分子间的静电斥力，但由于水膜的存在，蛋白质仍有肯定的溶解度而沉淀不完全，所以等电沉淀法常常与盐析法或有机溶剂沉淀法联合使用单独使用等电点法主要是用于去除等电点相距较大的杂蛋白在加酸或加碱调整 pH 的过程中，要一边搅拌一边渐渐参加，以防止局部过酸或过碱 。
〔二〕非离子多聚物沉淀法：聚乙二醇〔PEG〕，葡聚糖，右旋糖苷硫酸钠等非离子多聚物可以沉淀蛋白质和细菌沉淀机理：空间位置排斥效应试剂溶解度大，在水中占据大局部空间，将需沉淀物相互靠近，增加碰撞机率优点：〔1〕操作条件温顺，不易引起变性；〔2〕具有极高的沉淀效率；〔3〕沉淀后多聚物简洁除去 应用： 沉淀分别细菌，病毒蛋白〔三〕成盐沉淀法（1） 金属离子沉淀法 ：蛋白质在碱性溶液中带负电荷，能与金属离子形成金属复合盐沉淀 常用的金属离子 Zn2+、Ca2+、Pb2＋ 〔2〕有机酸沉淀法 〔3〕无机酸沉淀法：磷钨酸、磷钼酸等能与阳离子形式的蛋白质形成溶解度极低的复合盐，从而使蛋白质沉淀析出特点：常使蛋白质发生不行逆的沉淀，应用时必需慎重〔四〕选择性变性沉淀法：选择肯定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白变性沉淀而不影响所需蛋白质的方法称为选择性变性沉淀法⑴ 热变性利用生物大分子对热的稳定性不同，加热上升温度使非目的生物大分子变性沉淀而保存目的物在溶液中⑵ 外表活性剂和有机溶剂变性使那些对外表活性剂和有机溶剂敏感性强的杂蛋白变性沉淀通常在冰浴或冷室中进展⑶ 选择性酸碱变性 利用对 pH 值的稳定性不同而使杂蛋白变性沉淀。
通常是在分别纯化流程中附带进展的分别纯化步骤应用此法，应对欲提纯蛋白质和杂蛋白的理化性质有较全面的了解其次节 结晶法结晶是制备纯物质的有效方法在生物技术中，结晶主要应用于抗生素、氨基酸、有机酸等小分子的生产中，以作为精制的一种手段 固体有结晶和无定形两种状态，两者的区分在于它们的构成单位的排列方式不同，前者有规章，后者无规章由于只有同类分子或离子才能排列成晶体，故结晶过程有很好的选择性，析出的晶体纯度较高结晶是指物质从液态(溶液或熔融体)或蒸气形成晶体的过程,是获得纯洁固态物质的重要方法之一为数众多的化工产品都是应用结晶方法分别或提纯而得到的晶态物质以盐和糖为例,世界的年生产力量已超过 1 亿吨; 化肥如硝酸铵、氯化钾、尿素、磷酸胺等世界的年生产量亦已超过了100 万吨;在医药、染料、精细化工生产中, 虽然结晶态产品产量相对较低,但具有特别重要的地位以及高额的产值在冶金工业、材料工业中, 结晶亦是关键的单元操作值得留意的动向是在高技术领域中,结晶操作。