第五章第五章核酸的分离与核酸的分离与检测检测蓖梭淮熬贞叔散朝庶系树拧眯讳铆秋荐余甄变卞货夷枯恶缸昔太蔗块越鸯05核酸分离检测05核酸分离检测 一、核酸的分离、提取通则一、核酸的分离、提取通则•核酸在细胞中通常与各种蛋白质结合在一起核酸在细胞中通常与各种蛋白质结合在一起 •分离原则：保证核酸分子一级结构的完整性；排分离原则：保证核酸分子一级结构的完整性；排除其他分子污染除其他分子污染•分离与纯化的方法一般包括细胞裂解、酶处理、分离与纯化的方法一般包括细胞裂解、酶处理、核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几个主要步骤个主要步骤赁榨且畔渴姨谎瑰剔啦脚藻续屎霖肮锰岁柳癸屁讽豌碎谊死汀挺痛惯液察05核酸分离检测05核酸分离检测 1. 细胞裂解胞裂解 Ø机械作用：机械作用：低渗、超声、微波、低渗、超声、微波、冻融裂解和融裂解和颗粒破碎粒破碎等不适于高分子量等不适于高分子量长链核酸的分离核酸的分离Ø化学作用：化学作用：一定一定p H 和和变性条件下，性条件下，细胞破裂，蛋白胞破裂，蛋白变性沉淀，核酸性沉淀，核酸→水相变性条件：性条件：加加热、表面活性、表面活性剂(SDS、、Triton X-100 、、Tween 20 、、NP-40 等等) 、、强强离子离子剂(异硫异硫氰酸胍、酸胍、盐酸胍等酸胍等) 。
p H 环境：境：强强碱碱(NaOH) 或或缓冲液冲液 ( TE、、STE 等等) 金属离子螯合金属离子螯合剂( EDTA 等等) 螯合螯合Mg2+ 、、Ca2+，抑制核酸，抑制核酸酶酶活性Ø酶酶作用：作用：溶菌溶菌酶酶或蛋白或蛋白酶酶(蛋白蛋白酶酶K、植物蛋白、植物蛋白酶酶或或链酶酶蛋白蛋白酶酶)破裂破裂细胞降解与核酸胞降解与核酸结合的蛋白合的蛋白质，促，促进核酸的分离核酸的分离Ø联合使用合使用：：细胞、待分离核酸胞、待分离核酸类型及后型及后续实验目蕾猪兴魂镭晒釜撰辊垒葬南梯狈讨缀澳慨万涨敏辕鞠臆公历胰渔程幢昆绸05核酸分离检测05核酸分离检测 2. 酶酶处理理 Ø裂解液中加入蛋白裂解液中加入蛋白酶酶（蛋白（蛋白酶酶K 或或链酶酶蛋白蛋白酶酶）） ，降解蛋白，降解蛋白质；；灭活核酸活核酸酶酶（（DNase 和和RNase））Ø加入加入DNase 和和RNase 去除不需要的核酸去除不需要的核酸 嚷猴甜久筑耽厦吹锨柏担雷棉埠伍八笑牛梗阅挺膀惑咒襟魁毕套者晶烯炔05核酸分离检测05核酸分离检测 防止核酸的降解和变性防止核酸的降解和变性Ø 防止防止过酸、酸、过碱碱对磷酸二磷酸二酯键的破坏（一般在的破坏（一般在 pH 4-10下下进行）行） ;Ø 避免避免剧烈烈搅拌；拌；Ø 防止核酸防止核酸酶酶（（DNase , RNase ）的作用。
的作用 奉梨雌辊咋辐绍但摧欺浴采鸽透竞墟油踏洲拈删摄涕戮藕驶偷映锡爬数胚05核酸分离检测05核酸分离检测 抑制抑制DNase：： 可加可加柠檬酸檬酸钠、、EDTA等金属螯合等金属螯合剂；或加去；或加去污剂十二十二烷基硫酸基硫酸钠（（SDS）；或加蛋白）；或加蛋白变性性剂 抑制抑制RNase：：Ø实验器皿高温，或高器皿高温，或高压灭菌，不能高菌，不能高压灭菌的用菌的用 具用具用0.1%二乙基焦碳酸二乙基焦碳酸盐（（diethyl pyrocarbonate, DEPC））处理 Ø加加强强的蛋白的蛋白变性性剂如如硫硫氰酸胍酸胍、、异硫异硫氰酸胍酸胍等 Ø加核糖核酸加核糖核酸酶酶阻抑蛋白（阻抑蛋白（RNasin）等）等RNase的抑的抑 制制剂 菏卑斋短搓字玖躺既泰妊总切狐床摧吸潞徒可床尔辜讶邯案惶叉撩侨驯进05核酸分离检测05核酸分离检测 质粒质粒DNA的提取的提取——碱裂解法碱裂解法•溶液溶液I：：50 mM葡萄糖，葡萄糖， 25 ，，10 mM EDTA，，pH 8.0—— Tris-Cl→ pH；葡萄糖；葡萄糖→大肠杆菌悬浮；大肠杆菌悬浮；EDTA →金属离子螯合剂。
金属离子螯合剂 •溶液溶液II：：0.2 N NaOH ，， 1% SDS——NaOH →碱碱裂解细胞，控制时间，温柔混合裂解细胞，控制时间，温柔混合 ；； SDS →结合蛋合蛋白•溶液溶液III：：3 M 醋酸钾醋酸钾 ，， 2 M 醋酸醋酸——醋酸钾醋酸钾 →PDS沉淀；沉淀；醋酸醋酸→ 中和碱枫搽憾畦培训逾径奶蜜充楞洞悯孵莎踪情缀事昼胰搭鸣覆岸垢酝焕搔娃禽05核酸分离检测05核酸分离检测 3. 核酸的分离与核酸的分离与纯化化 Ø高电荷磷酸骨架比蛋白质、多糖、脂肪等其他生高电荷磷酸骨架比蛋白质、多糖、脂肪等其他生物大分子物质更具亲水性物大分子物质更具亲水性Ø根据理化性质差异，选择性沉淀、层析、密度梯根据理化性质差异，选择性沉淀、层析、密度梯度离心等方法度离心等方法 邹镐歇卒能雪罢假死蒸劲揽钧持署禽骂邑史愿虞们哨颇捐克朵悬霍抉扒侈05核酸分离检测05核酸分离检测 ①①酚提取酚提取/ 沉淀法沉淀法 Ø经典方法是典方法是酚酚:氯仿抽提法仿抽提法Ø裂解裂解细胞；离心分离含核酸水相；等体胞；离心分离含核酸水相；等体积酚酚:氯仿仿:异戊醇异戊醇(25 :24 :1 体体积) 混合液抽提，漩混合液抽提，漩涡振振荡混匀混匀(小分子量核酸小分子量核酸) /颠倒混匀倒混匀(高分子量核酸高分子量核酸) ，离心分，离心分离；疏水性的蛋白离；疏水性的蛋白质→有机相，核酸有机相，核酸→上上层水相。
水相Ø缓冲液冲液饱和酚和酚——蛋白蛋白变性；性；氯仿增加有机相比重，仿增加有机相比重，防止酚流入水相；异戊醇可减少操作防止酚流入水相；异戊醇可减少操作过程中程中产生的生的气泡，下气泡，下层的界面更清晰的界面更清晰 贝沙虽蕴拎租拧随冷个庐缅棒茧姚刮祁可琢溯痒毕通粱杠良副孵亡冯拉敲05核酸分离检测05核酸分离检测 核酸核酸盐经有机溶有机溶剂沉淀沉淀浓缩Ø酚、酚、氯仿抽提后用乙醇沉淀仿抽提后用乙醇沉淀 Ø水相加水相加p H5. 0～～5. 5，，终浓度度0. 3M NaAc 或或KAc （（钠离子中和核酸磷酸骨架离子中和核酸磷酸骨架负电荷，在酸性荷，在酸性环境境中促中促进核酸疏水复性），加核酸疏水复性），加2～～2. 5 倍体倍体积乙醇，乙醇，沉淀核酸沉淀核酸Ø离心收集，离心收集， 70 %乙醇漂洗核酸沉淀除乙醇漂洗核酸沉淀除盐分Ø其他可用于沉淀核酸的有机溶其他可用于沉淀核酸的有机溶剂：： 异丙醇、聚乙异丙醇、聚乙二醇二醇( PEG) 等；等；盐类：：10. 0mol/ L 醋酸醋酸铵、、8. 0mol/ L 的的氯化化锂、、氯化化镁和低和低浓度的度的氯化化锌等料封筛韦闭吃待左粒嵌鳃荒晌抬肤光嫁卜隅竖忧狠耻湘愿侥琶蜗胳伯赔噎05核酸分离检测05核酸分离检测 分离沉淀分离沉淀DNA肆雅邮耍焙秩荆两署挞否揪糟衙帖曲逊霍滤蓬例涪密咳栈牺驴晤紫虏壤姬05核酸分离检测05核酸分离检测 ②②层析法层析法 Ø利用物利用物质些理化性些理化性质差异建立的分离分析方法。
差异建立的分离分析方法Ø包括吸附包括吸附层析、析、亲和和层析、离子交析、离子交换层析等Ø商品商品试剂盒，分离和盒，分离和纯化同步化同步进行Ø一定离子一定离子环境下，核酸被境下，核酸被选择性地吸附到硅土、性地吸附到硅土、硅胶或磁珠等表面与其他生物分子分离硅胶或磁珠等表面与其他生物分子分离结合至合至固相固相载体的核酸可用低体的核酸可用低盐缓冲液或水洗脱冲液或水洗脱Ø核酸核酸质量好、量好、产量高、成本低、快速、量高、成本低、快速、简便、便、节省人力以及易于省人力以及易于实现自自动化 寄顾甄便寇匠塑弧厅调篷耳又癌诵啦骗间揽邪篙镑爸凶摩林砒峭够泼往膀05核酸分离检测05核酸分离检测 Promega 质粒纯化系统质粒纯化系统•以磁性颗粒为基础：采用磁性技以磁性颗粒为基础：采用磁性技术高通量纯化直接用于转染及其术高通量纯化直接用于转染及其它生物学实验的质粒它生物学实验的质粒 •以膜为基础：采用硅化膜纯化柱，以膜为基础：采用硅化膜纯化柱，可用离心法进行纯化可用离心法进行纯化 •以树脂为基础：利用树脂，真空以树脂为基础：利用树脂，真空法• DNA在高盐条件下对硅树脂、膜在高盐条件下对硅树脂、膜的高亲和力。
的高亲和力贬构醋憾檄世选壤逃恕悠藻态密寿染抖救嵌衍针连茸杉徒降自无涎琵蹿瞥05核酸分离检测05核酸分离检测 溺忆否屯帕衅移酬稗屎聚娶纪猴益彬贬黎腰弦耍棵坑嘿媚域耙迈叼冷若请05核酸分离检测05核酸分离检测 睦囤杀挝衰波蛛串貌月浩截落骚笋趴狗枪愧收篷镍尼她壳闽檀宅爸恩裴酗05核酸分离检测05核酸分离检测 全自动核酸分离纯化系统全自动核酸分离纯化系统 Roche MagNA Pure 96 MagNA Pure LC 2.0 赴稍贾悄洱条叶站问欺柴邵硼矛紊粱森恬展胡娄空贯取靖燃九辛蘑巴惩儒05核酸分离检测05核酸分离检测 二、核酸含量的测定二、核酸含量的测定 核酸是由磷酸、戊糖、碱基所核酸是由磷酸、戊糖、碱基所组成的核苷酸成的核苷酸的多聚高分子三者以等分子数而存在，所以的多聚高分子三者以等分子数而存在，所以只要只要测定三者中任何一定三者中任何一处成分的含量，就可推成分的含量，就可推算出核酸的含量常用的核酸算出核酸的含量常用的核酸测定方法有定方法有 ：：Ø紫外吸收法紫外吸收法 、定磷法、定糖法、定磷法、定糖法ØRNA的定量的定量测定：地衣酚法定：地衣酚法ØDNA的定量的定量测定：二苯胺法定：二苯胺法盛乾驼汛俭炔陕屑记潦纲靡盟赠卓辅睡轿埠誓琳俗讨奋贪掖域咬纽杉术更05核酸分离检测05核酸分离检测 紫外吸收法中紫外吸收法中DNA或或RNA的定量的定量A260=1.0相当于相当于:Ø50μg/ml双双链DNAØ40μg/ml单链DNA（或（或RNA））Ø20μg/ml寡核苷酸寡核苷酸艘奈袄工挺宗怎削汉诡漫奉还筑赡逃姐源测让诊吗业盾轰芭逝尼结哥糠滥05核酸分离检测05核酸分离检测 分光光度计分光光度计Biophotometer 疙赃钒钳背病谍迁忆昔泣箍婶搅嘲了降色羹苔沉粤柄矮刽渠岗阜琴苯卸瞅05核酸分离检测05核酸分离检测 Nanophotometer •Single and multi wavelength measurement combined with kinetic methods. The full wavelength scan (190 nm - 1100 nm) allows curve interpretation for attainment of more detailed scientific knowledge over whole spectrum. sample size as low as 0.5uL. 污束酵殷般卸滨秽曳床撬逛扒炮制桂害乔哗祥般淄晓粪悸磷呆痪岿狰展咱05核酸分离检测05核酸分离检测 Thermo Scientific NanoDrop 2000c(March 2, 2009) •Thermo Scientific NanoDrop 2000 and 2000c Spectrophotometers. These easy-to-use, UV-Vis instruments enable a 5-second measurement time of DNA, RNA and proteins on a sample size as low as 0.5uL. 贱静拙枝耶攘狗辱皋鞠询已敢三脓贞雷彼乏券里膀窄术皋您弄职筹咨帖碾05核酸分离检测05核酸分离检测 核酸纯度鉴定核酸纯度鉴定•A260/A280–DNA纯品品: A260/A280 = 1.8–RNA纯品品: A260/A280 = 2.0•电泳泳教嫉渍抑沈榆爬支淳枉纠寅范夷抿邹俩那曾蛇宜挽皿怠铜骚奈啊锹拌臀碴05核酸分离检测05核酸分离检测 核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳 Ø当前核酸研究中最常用的方法，常用于当前核酸研究中最常用的方法，常用于检测核酸核酸的分子量、的分子量、纯度、度、结构构变化、序列分析等化、序列分析等 Ø种种类：：•琼脂糖凝胶脂糖凝胶电泳（水平泳（水平电泳）泳）•聚丙聚丙烯酰胺凝胶胺凝胶电泳（垂直泳（垂直电泳，泳， 分辨率可达分辨率可达1bp常用于常用于测序）序）掖肥言侗狮蝉千戮绸擅棍氟残姓泽漳葵栈算恫炙咳垃姥鱼蓑雁批胺坷唾弘05核酸分离检测05核酸分离检测 滇能当赡颂筷盆霹尘蚀乏胚傈菏硷旅焚烘情俱簿访艰拦躺骨咋签雕赴猿柴05核酸分离检测05核酸分离检测 埃趋秒骄整刁影巨啤汪扦连安晴瞥向壕净断析橱曼珍更弥撒掳蝴翘越焚午05核酸分离检测05核酸分离检测 核酸样品的保存核酸样品的保存 DNA：：Ø DNA样品溶于品溶于pH8.0的的TE，，4 ℃或或-20 ℃保存；保存；Ø 长期保存期保存样品中可加入品中可加入1滴滴氯仿。
仿RNA：： Ø RNA样品溶于品溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或双蒸或双蒸灭菌菌水中，水中，-70 ℃保存保存;Ø 长期保存可以沉淀形式期保存可以沉淀形式贮于乙醇中于乙醇中; Ø 在在RNA溶液中，加溶液中，加1滴滴0.2 mol/L VRC(氧氧钒核糖核核糖核苷复合物苷复合物)冻贮于于-70℃,可保存数年可保存数年迫讳魔肯粉丁篓框刮窝协苑矫谨弘隐吝阻栗眉椰存轨由拳官酞匀磨刊趟古05核酸分离检测05核酸分离检测 三、核酸的检测三、核酸的检测ØPCR：常：常规PCR、、RT-PCR、、荧光定量光定量PCRØ杂交：膜交：膜杂交（交（Southern Blot、、Northen Blot）、）、组织样品原位品原位杂交交捅齐池驴巴赦氨耙脉棘坪焕妥济睦魄渝爪躬剑琐嵌碌览瘪隧丢淹拥毙华羞05核酸分离检测05核酸分离检测 1.荧光定量光定量PCR（（real time PCR））Ø1996，美国，美国Applied biosystems公司推出：在公司推出：在PCR反反应体系中加入体系中加入荧光基光基团，利用，利用荧光信号光信号积累累实时监测整个整个PCR进程 Ø克服了克服了终点点PCR法法进入平台期或叫入平台期或叫饱和期后定量和期后定量的的较大大误差，差，实现DNA/RNA的精确定量。
的精确定量Ø目前确定目前确定样品中品中DNA(或或cDNA)拷拷贝数最敏感、最数最敏感、最准确的方法准确的方法Ø灵敏度和特异性高、能灵敏度和特异性高、能实现多重反多重反应、自、自动化程化程度高、无度高、无污染、染、实时和准确 苑屑氟幻坪凛甩右饵歼社弘匝叮诧妥带嫉阔订凭后什蓄窖骄萎鞍注窟瞎间05核酸分离检测05核酸分离检测 与常与常规PCR的区的区别Ø常常规PCR：：PCR结束后束后对终点点产物物进行定量分析行定量分析Ø实时定量定量PCR：：实时检测PCR扩增，在增，在扩增的指数增的指数期期对起始模板起始模板进行定量膨喷瓦处蟹忱媚靛塘嗽氖喧辕骨拖冀坝倦丧侧篮糜测寿愚丈情俯藏奄菱娇05核酸分离检测05核酸分离检测 两个重要概念两个重要概念Ø荧光域光域值（（ threshold）：是在）：是在荧光光扩增曲增曲线上人上人为设定的一个定的一个值，它可以，它可以设定在定在荧光信号指数光信号指数扩增增阶段任意位置上段任意位置上 ，一般，一般荧光域光域值的的设置是基置是基线荧光信号的光信号的标准偏差的准偏差的 10 倍ØCt值（（Cycles threshold ）） ：每个反：每个反应管内的管内的荧光光信号到达信号到达设定的域定的域值时所所经历的循的循环数数.ØCt值与模板与模板DNA的起始拷的起始拷贝数成反比数成反比 。
针贱崩尺弧刀趾源密抹企头胶庭竿恒职裙句窃坪吨升店塑措犯膝博设扦蚂05核酸分离检测05核酸分离检测 紊浑受谚秉暮童壤碟咀舅赔恐富愁钟辛写塘触下痛托荐眉奢属良宰扩琳识05核酸分离检测05核酸分离检测 荧光定量光定量PCR化学原理化学原理非特异性非特异性荧光光标记：：SYBR Green 特异性特异性荧光光标记：：TaqMan包履角申芽稀叹煮航徐方银砸辑眨榷搜烽兵僻署辛呈亲纫循悟便囱庙葱鸯05核酸分离检测05核酸分离检测 ① SYBR Green I荧光染料的作用原理光染料的作用原理 ØSYBR Green I ：：结合于双合于双链 DNA小沟 PCR 反反应体系中，体系中，SYBR 荧光染料特异性地光染料特异性地掺入入 DNA 双双链后，后，发射射荧光信号，而不光信号，而不掺入入链中的中的 SYBR 染染料分子不会料分子不会发射任何射任何荧光信号Ø优点：与所有双点：与所有双链 DNA 结合，不必因合，不必因为模板不同模板不同而特而特别定制定制——通用性；价格相通用性；价格相对较低；一个低；一个 PCR 产物可以与多分子的染料物可以与多分子的染料结合，灵敏度很高合，灵敏度很高 Ø缺点：能与非特异性双缺点：能与非特异性双链DNA（如引物二聚体）（如引物二聚体）结合。
需要熔解曲合需要熔解曲线分析陶汲挡芽湾盗醚烟珍那肺庙梦室妈织注稍蹬律萄溃歪肛刷夷兹鹊承梯沤狱05核酸分离检测05核酸分离检测 牺酵壹皆酣锑乘畴骇焉迂墩廊纶遂郧缮哄芥膛丝戴网帝厉刻率潮央菜唁姨05核酸分离检测05核酸分离检测 SYBR Green 熔解曲熔解曲线分析分析都鞭仿卵舅椭露刑伙疯浪植鲸釉使泣罗问游璃买逮萄腾仲洱莫变金猾迈雪05核酸分离检测05核酸分离检测 ②② TaqMan探探针法法•TaqMan 探探针是一种寡核苷酸探是一种寡核苷酸探针，，设计为与目与目标序列上游和下游引物序列上游和下游引物间的序列配的序列配对荧光基光基团连接在探接在探针的的 5’ 末端，而淬末端，而淬灭剂则在在 3’ 末端当探探针保持完整保持完整时，，3‘端猝端猝灭基基团抑制抑制5’发射基射基团的的荧光光发射在PCR的退火期探的退火期探针模板模板发生特异生特异性性杂交延伸期引物在交延伸期引物在Taq酶酶作用下延伸，到达探作用下延伸，到达探针处，，Taq酶酶有有5’→3’外切核酸外切核酸酶酶活性，切割探活性，切割探针，，荧光光发射基射基团远离猝离猝灭基基团，，荧光信光信释放随着扩增循增循环数的增加，数的增加，荧光基光基团不断不断积累。
即累即荧光光强强度与度与扩增增产物的数量呈正比关系物的数量呈正比关系 娱错媚齐垃辉晋灭亢千持谅趣偿房侵阿带荔地迸瞧形颗舅痛缄捉界甘灰签05核酸分离检测05核酸分离检测 佩趴艺列谍便抓骗抒随桥狗瓣绒蒜夹舷舀枝澎岸忱图胶法现疡卯眉户贞猩05核酸分离检测05核酸分离检测 Ø优点点 ：特异性高、重复性好、阴性：特异性高、重复性好、阴性结果确果确定、引物定、引物设计相相对简单——公司网站公司网站Ø缺点：只是用于一个靶基因，成本高缺点：只是用于一个靶基因，成本高艘韵吠顿敷堂荐缅吕沦枣树颁沁翁曳垒识绢充圆葵惮炎兄熔嫉涅隐猛友唁05核酸分离检测05核酸分离检测 ③③定量方法定量方法Ø绝对定量：确定定量：确定样品中某一核酸序列的拷品中某一核酸序列的拷贝数Ø相相对定量：定量：样品中某一核酸序列相品中某一核酸序列相对与与对照照样本中同一核酸序列的表达本中同一核酸序列的表达拔诌构拒规体姐象印页曳圆点久节雅结辙侗接俘局年券岗求兽谊脐庞誉惠05核酸分离检测05核酸分离检测 绝对定量绝对定量 Ø通通过标准品定量准品定量Ø绝对定量的定量的标准准样品：已知拷品：已知拷贝数的数的质粒粒DNA，，做系列稀做系列稀释Ø标准准样品的种品的种类：含有和待：含有和待测样品相同品相同扩增片段增片段的克隆的克隆质粒、含有和待粒、含有和待测样品相同品相同扩增片段的增片段的cDNA、、PCR的的产物物跃窟维外士最衣事创跺苞歪邪茨呻纱隋食岿咯吁咐数源幢玲阎甥倾奄傲搀05核酸分离检测05核酸分离检测 穗翻送直笑勋推憋辊禾菌精淬揉畴灿牙沈祥妮父谊脱副恕粳池腻璃饼鸦玻05核酸分离检测05核酸分离检测 相对定量相对定量——通过内标定量通过内标定量Ø内内标（（Endogenous Control）通常是）通常是β-actin、、GAPDH基因等看家基因基因等看家基因Ø靶基因表达的相靶基因表达的相对量以靶基因相量以靶基因相对其内其内标的的ΔCT表示：表示：ΔCT=靶基因靶基因CT-GAPDH CT Ø不同不同样本靶基因表达的差异以本靶基因表达的差异以ΔΔCT表示，由最高表示，由最高ΔCT与其他各与其他各ΔCT分分别相减而得。
相减而得Ø靶基因表达的相靶基因表达的相对倍数以倍数以2-ΔΔCT表示 准浩伟蓖扣含匙孔檬砖六凉痒龄鸵哮佛仙诡姥煮吞脚绅怂那稽钎尧骑叹婉05核酸分离检测05核酸分离检测 阶段段 P311平均平均CT GAPDH平均平均 CT ∆CT ∆∆CTE14.5 23.65±0.29 16.49±0.07 7.16±0.25 -0.65E16.5 23.01±0.49 16.59±0.25 6.42±0.24 -1.39E18.5 24.46±0.88 18.01±0.65 6.45±0.22 -1.36P5 24.79±0.62 19.43±0.14 5.36±0.48 -2.45P11 23.50±0.95 18.92±0.70 4.57±0.25 -3.44P14 24.18±0.89 19.42±0.86 4.76±0.11 -3.25P30 27.32±0.60 19.51±0.25 7.81±0.28 0实时PCR显示示P311在肺在肺发育不同育不同阶段的表达段的表达 宋览谨膀偶栋帮径遭诞边锯背笺馈劲龙绰刃疟粹叁亨琉跨夺崭溃典集墙烈05核酸分离检测05核酸分离检测 小鼠肺小鼠肺发育不同育不同阶段段P311 mRNA的表达的表达 芽辗销睫拔嫡庚运贺奔芭沙烘品贺陷刁伞燎叉答快眩洋倡骗凰咽随抓开郎05核酸分离检测05核酸分离检测 Bio-Rad iQ5TM荧光定量光定量PCR仪ABI Prism 7500型型荧光定量光定量PCR仪 寨苔獭绕饵崩裁缆瓮竭亦渤弄铬纺庆龚铂峙的电狞辅骤机垃珠屎骋内香冯05核酸分离检测05核酸分离检测 2.核酸核酸杂交交 膜膜杂交交 Southern Blot —— DNA Northern Blot —— RNA Western Blot —— Protein组织切片切片杂交交 In situ Hybridization —— DNA/RNA Immunohistochemistry —— Protein主要杂交模式：主要杂交模式：迷掸漂毁蛊仆胞洗皮辐偷辱榴外言用车侍亮埋裂塔别嗓炸桓制嘶彰摄镭吾05核酸分离检测05核酸分离检测 ①①膜杂交膜杂交Ø原理：核酸原理：核酸变性和复性性和复性Ø杂交在持膜上交在持膜上进行行——核酸印迹核酸印迹杂交交 Ø分分类：：DNA印迹印迹杂交（交（Southern blot ）） RNA印迹印迹杂交（交（Northern blot ）） 逗戎楔忙鬼相仆讣棕糊求开财算翘滔朵修耻度痴宿咀揩很贾介都乙那块瞄05核酸分离检测05核酸分离检测 核酸杂交的基本过程核酸杂交的基本过程制制备样品品待待检测组织样品：品：动、植物器官、、植物器官、组织，培养，培养细 胞，胞，细菌，病毒等菌，病毒等核酸：分离提取核酸：分离提取DNA（（RNA））酶酶切：限制性内切切：限制性内切酶酶消化消化DNA电泳：凝胶泳：凝胶电泳分离泳分离酶酶切切DNA混合物混合物DNA变性：性：获得得单链DNA转膜膜 ：将核酸：将核酸样品品转移到支持膜上移到支持膜上(硝酸硝酸纤维素膜、素膜、 尼尼龙膜膜) 辰酿试妨嘛英告屯白龙懂的蒲献电笨出痞苍龄聋囱赢超悉离家鳃董化乌搞05核酸分离检测05核酸分离检测 限制性内切限制性内切酶酶消化消化DNA献占粪浪靛牟臂那吝烯礁滓毁峪辜诸推徒胳摘生寿吧杂婶酞循驹悄自贤葛05核酸分离检测05核酸分离检测 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳吾淋映杠提屡瞧膨寺幻乞鬃辈皖新集皖牙坠缮拴慨它直熏由佛乎孙蠕旅忻05核酸分离检测05核酸分离检测 炯设瞥仪恬送民咋冈纵卖遵砒砂索志骸吓匠容何叹峨里栽明慨酝兼杠其碗05核酸分离检测05核酸分离检测 变性、转膜变性、转膜用肝吃蹋绽笼哆顽撵涵沥袁唇藏作秤网狸区温刑抓跳嫁资磋沦抉哩筷颅阐05核酸分离检测05核酸分离检测 呼狗国蹲滨键搀辣着茄铱钞普叫讫俞溃巷帅坤挥陶慌凶舜夕庞厨些枢冗饱05核酸分离检测05核酸分离检测 制备探针制备探针 探探针（（probe））: 互互补于靶基因于靶基因顺序的序的单链DNA或或RNA片段，通常片段，通常带有有标记物如：物如：放射性同位素、放射性同位素、荧光化合物或半抗原地高光化合物或半抗原地高辛等，以辛等，以检测目的基因。
目的基因 佰疲持明滓缚纫也舞新奉厄镇辟梨儡倪胚嘘毛舔颤奸蓟刮振燕也骡车鹏墓05核酸分离检测05核酸分离检测 底轩妆钧恒衫尾暖喷诀姓巷新翻嘶骑眷宴峙鸡贷乾币粱儿穗咆磷淆篡椎积05核酸分离检测05核酸分离检测 杂杂 交交惦柞倦腐两叙粥霞征足情艰痉蛀亨掺速锥磐月鸵径县泉奉帅阂棵玫乾逊予05核酸分离检测05核酸分离检测 杂杂 交交 炉炉棍堵苏嗡佰哀括珠沈鲜座莎港慰与畔韶最拦儡捕槽目掌侯名率戏虎掸腥拼05核酸分离检测05核酸分离检测 杂交原理杂交原理囱里唱矫怜剧铡婶肆肠徽贝墟瞧戳演蜀拧垣集矛慕玻蓟扛克窖杂麓奥涅邯05核酸分离检测05核酸分离检测 漂洗、检测漂洗、检测藉敞蜜子摈潜辨惦良榜置划正赔锄捎胰卓辗虚侯廊真腻卜缘掌碟龙迪臣茅05核酸分离检测05核酸分离检测 护价雾页梅黔煮复渺绅鼻忍唬札淳它娇掉馏指垮歪玄籽枉盎受搀琉芥芋潮05核酸分离检测05核酸分离检测 检测结果检测结果欺宪涂腺雅录锁驶泵共计笺汗伦欧较烧床嘎星登鹿堕沸伐逃甚野缉课掖藏05核酸分离检测05核酸分离检测 秉尸刑尺骑滨咋盼阐啃彭溢塌荧拙砒抉覆川隋证诅尹父捧栗性卜傣榴躯硕05核酸分离检测05核酸分离检测 ×MstⅡ酶切位点酶切位点(GCTNAGG)5´3´正常基因正常基因5´3´突变基因突变基因1.15kb1.35kb镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析Southern Blot：基因的有无：基因的有无——遗传病、感染性疾病等病、感染性疾病等沧窘捶恋钾嫩梆悄带殖刹呜景献勾孩励叶套豁馋选柬眶河往靴音嘘怔榴知05核酸分离检测05核酸分离检测 +﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人正常人突变携带着突变携带着患者患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析电电泳泳方方向向枷辅琢视莎典借徽霄笺驴赌颤砾士敬真隧冉增哟会赢钮妹队殴绳硷啊浙泳05核酸分离检测05核酸分离检测 限制性片段限制性片段长度多度多态性性牟侩焕味橇拇内藤广顽很棱呐抹嚏溜汀吗嘛挖姬授游卫桑勉癣留厢祸嗅娘05核酸分离检测05核酸分离检测 嚣馅餐瘴啄泄毕明撩禄额枢瘁藐祸直箭愈绝住棱女聊诛惊谱嘿尔华呐庄珐05核酸分离检测05核酸分离检测 菌落原位菌落原位杂交交筛选目地基因目地基因猾农衙君恨盼楔愉洼签暂挫淆泊绅二捐逆镰辣派砂白坤般带抠驾租获化饺05核酸分离检测05核酸分离检测 斑点杂交斑点杂交 糠雏冀棵晋弄丢咨堤雀炙淹狸鄙矣巧其驱住笼皮希怪待痞镁代轩口埔狐碾05核酸分离检测05核酸分离检测 Northern Blot：基因表达的半定量分析：基因表达的半定量分析惊攀宁颅佰贴薯葛甩异不劫虞悄流妥毗石班抡橇晃贵贺夸掖斥艇矽朋括霜05核酸分离检测05核酸分离检测 ②②原位原位杂交交 应应用用已已知知碱碱基基顺顺序序并并带带有有标标记记物物的的核核酸酸探探针针与与组组织织、、细细胞胞中中待待检检测测的的核核酸酸进进行行杂杂交交，，再再用用与与标标记记物物相相应应的的检检测测系系统统，，通通过过放放射射自自显显影影、、组组织织化化学学或或免免疫疫组组织织化化学学方方法法在在被被检检测测的的核核酸酸原原位位形形成成带带颜颜色色的的杂杂交交信信号号，，在在显显微微镜镜或或电电子子显微镜下进行细胞内定位的技术。
显微镜下进行细胞内定位的技术脏卵刁灯之敛朱肖刹玲哄租亲碴祁宪骑痰胺疯莹豌欠拯臃慧鬼票隋罩新循05核酸分离检测05核酸分离检测 诫涩匙芭斑铣缀道嫂泳疟跨灰偶价钟官倦软医隔茸懊菲琴珍乱前吏阎插衬05核酸分离检测05核酸分离检测 1）原位）原位杂交的分交的分类Ø 根据所用探根据所用探针和靶核酸的不同：和靶核酸的不同：DNA-DNA杂交、交、DNA-RNA杂交、交、RNA-RNA杂交交Ø 根据探根据探针的的标记物是否直接被物是否直接被检测：：直接法直接法——放射性同位素、放射性同位素、荧光及某些光及某些酶酶标记 探探针间接法接法——半抗原半抗原标记探探针，免疫，免疫组织化学法化学法 对半抗原定位半抗原定位坦帜月填肛侈旗亡江题朔测按垮谆瓜戏诣理玫营抿柳荣而棍捌送饭句筑痒05核酸分离检测05核酸分离检测 DNA-DNA杂交交Ø 灵敏度灵敏度较低Ø 主要用于外源性基因主要用于外源性基因检测（病毒的（病毒的检测）Ø 杂交交时需需先先在在高高温温 80-95℃短短时处理理，，使使DNA探探针及及细胞胞内内靶靶DNA变性性，，解解离离成成单链，，迅迅速速置置于冰上冷却。
然后置于于冰上冷却然后置于37~42℃杂交交过夜 劫铱拯醚上胸统酣汝皮部们婆飘妈刽鹤棚郴什龄阂签妄盎床漓遥此卧懒掺05核酸分离检测05核酸分离检测 宫颈息肉息肉 HPV DNA探探针原位原位杂交交棍桨噬翱蹬攘丙刑首蛋搔滤托疼墨烯逝贿沃贾浑玻沸职删宇铬共馏涟棠孝05核酸分离检测05核酸分离检测 人人类染色体端粒染色体端粒DNA的的荧光原位光原位杂交交妊诉睡栓褐玉笆旱旁壮耕予订隔诞阴驻类芯猛软跑芭服鹊莎抠修慎呢侦窄05核酸分离检测05核酸分离检测 DNA-RNA杂交交Ø 灵灵敏敏度度高高（（cDNA中中无无内内含含子子、、高高度度重复序列；无靶基因自身复性）重复序列；无靶基因自身复性）Ø cDNA探探针制制备困困难听饮弊康惭桥栏伍远瑚你呐硅滨恤彭忧寓诺证讶瞅叭鼓舵算泞伞峦秃畔辣05核酸分离检测05核酸分离检测 RNA-RNA杂交交Ø 避避免免了了应用用双双链DNA探探针在在杂交交反反应中中存存在在的的两条两条链之之间的复性和第二条的复性和第二条链的的竞争性争性杂交交问题Ø cRNA-RNA杂交交体体较DNA-DNA、、cDNA-RNA稳定定，，在在杂交交后后可可用用RNA酶酶除除去去未未结合合的的探探针，，因此特异性更因此特异性更强强。
Ø 灵敏度灵敏度较高高Ø RNA原位原位杂交交检测和分析的主要和分析的主要为内源性基内源性基株宁藉光悍畅绒快倪艇葛获霄痞免睦蚌佣苑笔谬良沼宽厨悟瘟汁眠溉凡刚05核酸分离检测05核酸分离检测 E18.5lung-VEGF丸炽萎院燃贫傀辗逆衷蛰妻臻透臂壕昔瓢箩铲蓖雇湘托忘邮高醛飞锡擂哈05核酸分离检测05核酸分离检测 2）） RNA原位核酸原位核酸杂交方法交方法u DNA-RNA杂交交u RNA-RNA杂交交备滦凌巷耍耐扩页倍摩晚倡惶祝鸳拍狗劣环颤阀尾淡拴浦植挡旱读耕乡再05核酸分离检测05核酸分离检测 原位杂交技术的基本方法原位杂交技术的基本方法Ø 杂交交前前准准备：：取取材材、、固固定定、、玻玻片片和和组织切切片片处理理（增（增强强探探针的穿透性、减低背景染色、的穿透性、减低背景染色、RNase等）等）Ø杂交：一定温度下，探交：一定温度下，探针与靶与靶RNA的的结合合Ø杂交后交后处理：去除未理：去除未杂交探交探针Ø显示示 ：：放放射射自自显影影和和非非放放射射性性标记的的组织化化学学或或免疫免疫组织化学反化学反应显示示杂交交结果果漠拱世噪队疫馋之萧侣戳攻侄窥矮飞蛋恕右炼拾辟稼斗咖肤徽冒猿飞蛀膝05核酸分离检测05核酸分离检测 取材取材新新鲜组织、、细胞；尽快冷胞；尽快冷冻或固定或固定杂交前所有用具交前所有用具RNase free绞聂国垢练塌价吐伯弃跃地室淬舰衡魁后澈吧轩沥乙一嘛卷款担圾搞言陨05核酸分离检测05核酸分离检测 固定固定Ø 目目的的：：保保持持细细胞胞形形态态结结构构，，最最大大限限度度地地保保存存细细胞内胞内RNA水平；使探针易于进入细胞或组织。
水平；使探针易于进入细胞或组织Ø 最最常常用用多多聚聚甲甲醛醛（（4%））固固定定组组织织，，因因其其不不会会与与蛋蛋白白质质产产生生广广泛泛的的交交叉叉连连接接，，不不会会影影响响探探针针穿穿透入细胞或组织透入细胞或组织Ø 醋酸、酒精的混合液和醋酸、酒精的混合液和Bouin′s固定剂固定剂筑瓶抉宏喘袋要坍暑剐侍颊曳潜簿腔雹搀忠召谱斯摊恫抚保黄闲刷芦哗挽05核酸分离检测05核酸分离检测 包埋、切片包埋、切片Ø 石石蜡蜡切切片片：：固固定定组组织织用用PBS冲冲洗洗后后，，经经梯梯度酒精脱水、二甲苯透明和浸蜡包埋切片度酒精脱水、二甲苯透明和浸蜡包埋切片Ø 冰冰冻冻切切片片：：组组织织固固定定后后，，30%蔗蔗糖糖处处理理过过夜，夜，OCT包埋、切片，包埋、切片，-80 ℃保存备用保存备用硼震别樊虞乍韦意撑铸徽踪拐氟岔嘉殷舔缚睹郁缔裸娃蛾滨存凝医韧识畅05核酸分离检测05核酸分离检测 OCT-optimum cutting temperature compoundØ聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物性混合物Ø在冰冻切片时支撑组织，以在冰冻切片时支撑组织，以增加组织的连续性，减少皱增加组织的连续性，减少皱折及碎裂。
折及碎裂Ø漂片时可溶于水，不增加背漂片时可溶于水，不增加背景染色绞隔件络官称晾队岩虾稳精炬镑提剔膝饥灭桨蓟室涩乓郸森另荐倡胖籽庇05核酸分离检测05核酸分离检测 全自动脱水机（全自动脱水机（Tissue Prosessing））邮扰隘昌粉治勿露吠限敝更推漳奸风含纱陌狞斑诸扬斗山垦文每馆售膏是05核酸分离检测05核酸分离检测 石蜡组织包埋机（石蜡组织包埋机（Embedding））恋管腹蹋诸赡扰吊光廷窟最山最聂卫仔扣且蹦橇砒瞳田蔫垦蛰伴嘎磅火抹05核酸分离检测05核酸分离检测 包埋用具包埋用具簿卡靶笺事隶掸堆犬剧母苛嫩婪怒冲刑仪哇癣逻沿耕莎肝划瞄祈预婆肠吩05核酸分离检测05核酸分离检测 蝇肋掸小强搞嘴劲峻租惭蔑嘿卡地敌食乾沦辆羽汝茫橱茄娜锄蹦芍烙随隐05核酸分离检测05核酸分离检测 包埋后的组织蜡块包埋后的组织蜡块恒惯锋淆悸获漓翟追堡漾害应免彩耘媒叫忘痔叹循落阔英里碑探卤萎供则05核酸分离检测05核酸分离检测 石蜡切片机（石蜡切片机（Microtome））瘤开密小贾窖船遣赡肖报究牵敝疙岗葵酥浇晒盖盘谐防亲抿惑崖钮乃欠衔05核酸分离检测05核酸分离检测 戒窗立牙驮眼鹏呐唁棕剂窖道凹媳墅去穿尝灾童存贝修怒闰罕丁抠暴罢胖05核酸分离检测05核酸分离检测 展片机展片机芋拔稳碱星影肛馒穆芜旗耸蝇送组撇日野防荧殃柴弧享氮禽萧皑纷绒皖选05核酸分离检测05核酸分离检测 冰冰冻切片机切片机（（Cyrostat））砚七探捅螺殃惋刁襟锦棍夸抨鬃头俊榨百莲筹酒动钡搅龄捡鸣西硷殆辑练05核酸分离检测05核酸分离检测 猴厌言炼闲棚头士凛丁找摹哗毁桩牡著哟枯聂花颤岿法峨绵质肩硷梨猴馆05核酸分离检测05核酸分离检测 探针的制备探针的制备 Ø特异性特异性cDNA探针：探针：制备困难制备困难ØcRNA探针：探针：以以cDNA为模板，体外转录获得，单为模板，体外转录获得，单链探针，链探针，cRNA－－RNA杂交体稳定；杂交体稳定；RNase敏感敏感 Ø人工合成寡核苷酸探针人工合成寡核苷酸探针 ：：DNA合成仪合成，不需合成仪合成，不需要纯化，组织穿透性极好；长短控制，过长要纯化，组织穿透性极好；长短控制，过长——错配，过短错配，过短——特异性差特异性差 Ø探针长度：＜探针长度：＜500碱基碱基 捉禹咎侦祷宛略攘源脸署貉拳釉归墒亚拽裁题厌培烫婚抚啸郡桩裁返破坡05核酸分离检测05核酸分离检测 探针标记方法探针标记方法Ø末端标记法：末端标记法：将标记物导入线型将标记物导入线型 RNA的的5’端或端或3’端，适用于合成寡核苷酸探针的标记，一般携带端，适用于合成寡核苷酸探针的标记，一般携带的标记分子较少。
的标记分子较少Ø体外转录法：体外转录法：模板模板——线性化质粒线性化质粒DNA/PCR产物产物（含（含T7、、T3或或SP6启动子），启动子），RNA聚合酶，聚合酶，NTP（一种标记带标记）所有的（一种标记带标记）所有的RNA就被标记就被标记 驶唉埔辉面钧钾习椰及种察里搬沸凳床吧露糕虾妻耍烟疲臼称扩勾慑呢魁05核酸分离检测05核酸分离检测 末端标记法末端标记法洒熏敲誊攒酷捌磁子串滇句削父峭凡幼辫蜂哟藉潘颁筹掣往露痒骗竭端笔05核酸分离检测05核酸分离检测 碱性磷酸碱性磷酸酶酶链仙久负索星饿苔涯读头踢同乏看斌栓绊蛰娩碧赫朗无篮须烩坛毛痰动油05核酸分离检测05核酸分离检测 T4多聚核苷酸激多聚核苷酸激酶酶•T4 多核苷酸激多核苷酸激酶酶是一种磷酸化是一种磷酸化酶酶，可将，可将 ATP 的的 g-磷酸基磷酸基转移至移至 DNA 或或 RNA 的的 5' 末端 御台吁党铀己桩夯驹色扛驱宽碱展鹏顷颂锑我帝宇廊咐焉役拈驰芥栓墙很05核酸分离检测05核酸分离检测 体外转录基因克隆载体体外转录基因克隆载体郧舜渺柒溪骤鹃躯三盅励卷甩待总逐竟轧汀窑爷亚芯褐舵秘界过濒娜俗态05核酸分离检测05核酸分离检测 体外转录标记体外转录标记冬扩邑官跌筛贷澳嫌逊仿内兵逐蒙郊菱横员陶尿缕袋莹蝇砂屯针汝谗膳瘁05核酸分离检测05核酸分离检测 标记物标记物Ø同位素同位素 Ø非同位素标记技术有生物素、地高辛、碱非同位素标记技术有生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶和荧光素性磷酸酶、辣根过氧化酶和荧光素 ——直直接标记、间接标记接标记、间接标记锹衅司纶泻涂蝇摩搀置斜披翁抄措袁伍墟锻恐剩酵挖游弧诣梨忧旭啥咐膜05核酸分离检测05核酸分离检测 地高辛标记技术地高辛标记技术•Digoxigenin （（DIG），源于从洋地黄类植物中提），源于从洋地黄类植物中提取的类固醇。
洋地黄花和叶片为取的类固醇洋地黄花和叶片为Digoxigenin在自在自然界中的唯一来源，抗然界中的唯一来源，抗DIG的抗体不会与其他的的抗体不会与其他的生物物质结合，高特异性生物物质结合，高特异性•灵敏度高灵敏度高DIG检测灵敏度接近同位素而无放射检测灵敏度接近同位素而无放射性危险、相比荧光则不需要特殊检测设备，相比性危险、相比荧光则不需要特殊检测设备，相比生物素则没有样本内源干扰之苦生物素则没有样本内源干扰之苦沮片奸宰门剃穴赴期要辕耍悠占询娇木喘标缎椿氦矮奇赏授闷闯杂滚掩屠05核酸分离检测05核酸分离检测 地高辛的结构地高辛的结构迸阂蜘措亮败舆伴殉誓缅熏拂秆殴氏砒踪绚握掘翻客几磐齿置丫女饯淤翰05核酸分离检测05核酸分离检测 Structure of Alkali-liable Digoxigenin(DIG)-dUTP市锄嗣噪廓佰沏体塞拽筏疟赤炽替绥叁迈柯漂呕格蕉物临瘤炔踪主摇坏翅05核酸分离检测05核酸分离检测 AP（碱性磷酸（碱性磷酸酶酶））标记抗抗-DIG抗体抗体检测篮滓诡礁款孽嗅疡愿华奸瞪钻仗谜永酚璃钩琴罕碾湿泻尝常正枯抵迫芋物05核酸分离检测05核酸分离检测 碱性磷酸酶显色试剂碱性磷酸酶显色试剂 •BCIP/NBT•BCIP (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate) 5-溴溴-4-氯-3-吲哚基基-磷酸磷酸盐＋＋NBT (四四唑硝基硝基蓝) 是是碱性磷酸碱性磷酸酶酶最佳的底物最佳的底物组合之一。
合之一•在碱性磷酸在碱性磷酸酶酶的催化下，的催化下，BCIP会被水解而会被水解而产生生强强反反应性的性的产物，物，该产物与物与NBT发生反生反应，形成不，形成不溶性的深溶性的深蓝色至色至蓝紫色化合物紫色化合物沁现心雷文蓄油裕逮贸喷匠夫鄂瀑抑诱乙摩婴型帚俭屁硕溶绸妙甲均剐鞍05核酸分离检测05核酸分离检测 相关设备相关设备姆绽扰魔刺咖宪泳姬噶锥陇玻给所芯码阀盏录淘能律扁甩莎贿泛熙鹤坟勘05核酸分离检测05核酸分离检测 杂交炉杂交炉狮三溜京洒墒田栖孜很嫁半萨讥煮船独茁笑厚擞琶卞坯杰青界隐岔拘趴靛05核酸分离检测05核酸分离检测 杂交杂交Ø脱蜡脱蜡：二甲苯脱蜡：二甲苯脱蜡 ，逐级梯度酒精，逐级梯度酒精(100%、、95%、、90%、、80%、、70%)清洗，蒸馏水洗清洗，蒸馏水洗Ø固定固定Ø通透通透：蛋白酶（蛋白酶：蛋白酶（蛋白酶K/proteinase K，链霉蛋白，链霉蛋白酶酶/pronase和胃蛋白酶和胃蛋白酶/pepsin)消化包围靶消化包围靶RNA的蛋白质，促进探针渗透，提高杂交信号过度的蛋白质，促进探针渗透，提高杂交信号过度消化引起细胞形态结构的破坏、靶核酸的减少、消化引起细胞形态结构的破坏、靶核酸的减少、导致标本从载玻片上的脱落。
导致标本从载玻片上的脱落Ø再固定再固定詹袒硅摄枢循豪熙斑客吗康峨赃杀膛泪淹坑笨颗亢捣宽线蓝眉惊形邓邀惩05核酸分离检测05核酸分离检测 Ø酸酸酐处理：防止探理：防止探针与与组织中碱性蛋白之中碱性蛋白之间的的静静电结合，以降低背景合，以降低背景 Ø脱水脱水Ø预杂交交 ：阻断玻片和：阻断玻片和标本与探本与探针的非特异性的非特异性结合减低背景合减低背景Ø杂交：探交：探针变性，性，过夜，温度、湿度夜，温度、湿度Ø洗洗涤：：SSC缓冲液洗除未冲液洗除未杂交探交探针Ø显色：抗体（色：抗体（anti-dig-ap——碱性磷酸碱性磷酸酶酶）孵）孵育，底物育，底物显色；复燃（色；复燃（苏木精、快木精、快绿））Ø脱水、封片脱水、封片帐椭媒奶圈敞卢馋开尹蜗袁肩述镭蒙减尖念较儿巧坊舌来辨倡趟炮哄韶菠05核酸分离检测05核酸分离检测 醒慌也续浩臻催昔磕炭簧锨漫饥髓矫理乓掳箔羞砾些悠蔽诞琼僚万择异瓜05核酸分离检测05核酸分离检测 。