免疫球蛋白测定方法与影响因素九0三医院检验科 樊英俊 •免疫球蛋白（Ig）的种类：•IgG（IgG1-4亚类）、•IgA（IgA1-2亚类）、•IgM、•IgD、•Kappa、Lamda 一、免疫球蛋白的测定方法：•1、免疫球蛋白的测定方法分类 见表1•见表1 免疫球蛋白的测定方法分类 方 法 原 理 标本类型简 要 评 价盐沉淀（金沉淀） Ig在某些盐（金化合物）溶液中形成沉淀，再用总蛋白测定法测定Ig含量血清慢，非特异性，不能分类Ig，方法过时电 泳蛋白分离成Alb和各种球蛋白;Ig在γ带血清慢，不能分类Ig，是检测单克隆Ig的筛选方法免疫扩散（（彩扩法） ）Ig扩散到含有抗体的凝胶中行成一个环状的免疫沉淀线，环的直径与抗原浓度成正比血清体液 较准确，慢 免疫荧光吸附在固体表面的Ig与样品中的Ig竞争荧光标记抗体，荧光信号强弱与样品中的Ig成反比血清体液准确，慢 电免疫扩散（火箭电泳）Ig扩散到含有抗体的凝胶中完成电泳，凝胶火箭沉淀峰的高度与Ig浓度成正比血清准确，慢 放射免疫测定Ig与抗体反应置换放射标记的Ig，血清体液非常灵敏，用于IgE测定 透射比浊Ig与抗体反应，在沉淀剂条件下，生成的浊度与Ig浓度成正比血清快速 不能发现AGXS 终点散射比浊Ig与抗体反应，在沉淀剂条件下，其形成散射光强度与Ig浓度成正比血清体液快速，准确，可通过预反应发现AGXS 速率散射比浊Ig与抗体反应，在沉淀剂条件下，其形成散射光强度的速率与Ig浓度成正比血清体液快速，准确，可测定AGXS 目前临床常用免疫球蛋白测定方法：•免疫比浊法，包括•①、透射免疫比浊法：•②、终点散射免疫比浊法：•③、速率散射免疫比浊法： 二、免疫球蛋白测定的影响因素•包括: •①标准液；•②抗体；•③使用的仪器与测定方法；•④样本自身特性；•⑤实验室条件和操作人员技能； 1、标准液对测定结果的影响•1.1 标准液中Ig类型的不均一性：•1.2 标准液中Ig分子大小的不均一性•那么要求Ig标准液能代表健康人群平均水平的Ig类型和分子大小，基质效应要小。
•1.3 Ig的国际标准：•1.3.1 WHO 67/97•定义：每瓶含100IU的血浆蛋白冻干品 •WHO 67/97的明显缺限:•①标准品复溶后造成体积差异•②标定方法仅使用放射免疫扩散技术（RID），方法技术要求不严格不适用于现代免疫比浊技术•③同一特定蛋白的不同批参考标准间有明显差异•④在实际应用中，该标准不能解决特定蛋白免疫监测结果之间的可比性 •1.3.2 CRM－470 •1989年由国际临床化学学会（IFCC）会同美国病理学会（CAP），指定由Behring公司负责制备国际参考品1992年欧洲经济共同体的共同体参考局（Bureau Communitaire de Reference BCR）认可该国际参考品，并给予该参考品代号CRM－470（认可参考品470）为目前最权威的特定蛋白标准！ CRM－470 是如何制备的：•收集来自法国、德国、瑞典、瑞士、英国的364名供血者血液•CRM－470的制备要求： • 1〕 血液中无类风湿因子或单克隆组分；无黄疸、脂血、溶血；Hbsag,抗HIV，TP，抗HCV及梅毒血清试验均阴性 • 2〕 血清需及时分离冰冻 • 3〕 按照IFCC定值方案：27个定值实验室（欧洲、美国、日本），确保在监测时各标准、样品间无基体效应的差异和没有抗原过剩，测定都须作多个稀释（须以重量法校正），每个稀释样品作双份检测等。
•CRM-470 允许的测定方法为： 允许的测定方法为：•免疫透射比浊，免疫透射比浊，•免疫散射比浊，免疫散射比浊，•放射免疫扩散放射免疫扩散 2、抗体对测定结果的影响 2.1 免疫抗原• 确认制备抗体的抗原与使用的国际标准一致，包括Ig类型及比例和分子大小的一致性；• •2.2 免疫动物 •R型抗体和H型抗体•不同种类的动物产生的抗体与相同抗原反应不同，按等价带范围大小将抗体分为两种类型，即R型抗体和H型抗体•R型抗体，具有较宽的抗原抗体合适比例范围，只在抗原过量时，才出现溶性免疫复合物•H型抗体，其抗原与抗体的合适比例范围较窄，抗原或抗体过量，均可形成可溶性免疫复合物•R型抗体与抗原的亲和力比H型抗体强！•不同种类的动物产生的抗体测定也会影响检测结果 2.3 抗体储存对测定结果的影响 抗体储存会使其效价降低，抗体浓度越低，效价降低越快2.4 抗体批号对测定结果的影响 不同批号的抗体可因抗体的浓度不同、制备抗体的抗原差异以及免疫动物的反应性不同影响测定结果 3、常用测定方法与使用的仪器:测定方法与使用的仪器是影响Ig测定的最重要因素 目前临床常用免疫球蛋白测定方法：免疫比浊法免疫比浊法•3.1免疫比浊法的基本理论：•3.1.1 抗原与抗体的比例关系见图1 图1 抗原与抗体的比例关系 3.1.2不同大小抗原抗体复合物的光学性质见图不同大小抗原抗体复合物的光学性质见图2 •决定定抗原抗体复合物光学性质的因素决定定抗原抗体复合物光学性质的因素;•光线透射与散射的数量及特性取决于•复合物的直径(d), •发射光的波长()，•检测器与发射光的角度，•介质的折射系数有关。
•①大多数蛋白质分子比光的波长要小得多( 5-10nm), 只产生Rayleigh 散射•②在直接抗原抗体反应直接抗原抗体反应期间，最初形成的小复合物会通过交联而增大，到达大约3 x 10 E6 Da 大小的限度，产生Rayleign-Debye 散射•③在另一些反应中，抗体附着于大的颗粒上(IgE)，再和抗原形成的不可溶复合物，其大小较光的波长要大得多在这些情况下出现的是Mie 散射 •图2显示只有在0到12的小角度内，可以测量到所有大、中、小颗粒发散的散射光因此检测角度15 时大分子产生的影响就可得到最大消除，检测角度越大（≤90），大分子产生的影响就越小•该图还可以看出，70-90之间的大角度对于测定小分子颗粒的散射光(由Rayleigh 产生散射)适合得多，因为排除了大分子颗粒的可能干扰，将中度大小颗粒的影响也降到了最小 3.1.3非特异性反应非特异性反应•人们很早就发现PEG作为免疫沉淀反应的一种基本成分，可以增强抗原抗体的结合，减少仪器测定时间 •但他同样带来了不利因素--- 使得血清和血浆样本中存在的许多物质也增加了不可溶性•这些不可溶的颗粒物质同样使光线发散，有时甚至会随着抗原抗体反应的进行，在特异性信号之上叠加非特异性信号变动。
影响测定结果 以CICs为例说明这种非特异性反应 见图3图3：CICs的非特异性反应曲线 非特异性反应干扰的大小取决于以下几个因素：•①检测所用的样本最终稀释比率；•② PEG浓度 ；•③ pH值； •所有的系统都必须面对特定样本的这类困扰，但不同仪器造成错误结果的可能程度与大小是不同的，这取决于检测所用的技术原理(散射法还是透射法，终点法，固定时间法还是速率法)和样本最终稀释度•即：•样本最终稀释度：样本稀释度越高，存在非特异性反应的风险越低•PEG浓度：PEG浓度越高，存在非特异性反应的风险越高• 减小非特异性反应的唯一办法是以稀释液代替抗体进行空白对照检测这个程序只有少数仪器得以应用 3.1.4 样本的最终稀释度： •样本的稀释度不仅关系到非特异性反应的大小，还关系到体系中抗原抗体复合物的抗原抗体复合物的光学性质能否充分体现光学性质能否充分体现 影响样本最终稀释度的因素•样本的最终稀释度受限于：•①仪器的最小吸样本量及吸样精度；•②反应杯的最大可使用容量；•③检测器的灵敏度；•表2显示了三种仪器系统目前采用的稀释比例 FINAL SAMPLE DILUTIONS USED IN IMMUNOPRECIPITATION FINAL SAMPLE DILUTIONS USED IN IMMUNOPRECIPITATIONMETHODS TEST ABCIGA 1 : 113 1 : 2201 : 586IGG1 : 1341 : 12001 : 3522IGM1 : 113 1 : 1001 : 586表2 三种常用仪器样本的最终稀释度 3.2临床常用免疫比浊法 3.2.1 透射比浊法 •要使透射比浊法结果可靠，应满足：•①测定要全自动进行；•②样本的最终稀释度要高;•③多点定标；•④不要过零点：至少Ｈ型抗体不能过零点；•透射比浊法具有快速的优点，但有较多的缺陷 透射比浊法的缺陷：•①不能检查AGXS（抗原过剩）：影响测定结果•②样本不稀释或稀释度太低的影响：影响测定结果•③定标液的影响：使用异常高浓度或/和单一正常人血清的定标液将影响测定结果的准确性；•④脂血的影响：脂血对测定结果的影响大•⑤溶血和黄疸的影响：溶血和黄疸对测定结果有影响•⑥非特异性反应的影响：非特异性反应对测定结果影响较大• 3.2.2终点散射比浊法•以SIEMENS BN-Ⅱ为例•①① BN II的光学系统：的光学系统：测定角为17；使用840nm的红外区波长，能较好地适用于测量大复合物的散射光，尤其在使用胶乳结合抗体时；•BN II的光学系统模式图见图的光学系统模式图见图3,图图4 图3：散射比浊模式模式BN- II透射比浊模式图模式图 图4： BN- II ② BN II的测定方法：终点散射比浊法的测定方法：终点散射比浊法（固定时间测量法）（固定时间测量法） ③ 标准品与定标曲线及使用的公式•Ig标准品可溯源CRM470，•采用六点定标，•用Logit-log回归曲线， Logit-log回归曲线 Logit-log计算浓度 ④ 测量范围与可测量范围 ⑤ BN II的抗原过剩检测原理•预反应检测抗原过剩:•BN II只有三个项目(IgM,AFP,以及IgA)可运用预反应预反应原理(Pre-reaction) 进行抗原过量检查。
•抗原过量检查见图6 BN II的抗原过剩检测 IgM为例说明BN II的抗原过量检测原理 • 因此BN II在检测IgA和IgM时，能将抗原过剩的风险降到最低！• 但是， BN II的抗原过量不能完全消除，在极少数情况下，非常高的免疫球蛋白浓度可能会产生错误的低结果尤其是单克隆免疫球蛋白可能会显示与多克隆标准品不同的反应，在个别情况下，这可能会导致结果降低的假象或导致非线性结果 ⑥BN II的非特异性反应检测方式：•两种选择方式•BN II对所有样本进行非特异性反应鉴别的两种选择方式：•非特意性反应1•非特异性反应2 3.2.3、速率散射比浊法：•速率散射比浊法：以BECKMAN IMMAGE为例• ① IMMAGE的光学系统：•激光光源, •波长670nm,• 90度度 检测角检测Ig ② 标准品与定标曲线及使用的公式：•Ig标准品可溯源CRM470，•采用单点校正定标，•内置多点定标曲线（用Logit-log回归曲线）， ③ 测量范围：全程自动测定•因进行真正的抗原过量检测,能测定所有病理浓度的样本 ④ 抗原过量检测•进行真正的抗原过量检测•这项检测不会影响用来计算样本结果的速率峰信号。
•下面以IgM检测为例说明这个原理 IMMAGE检测IgM抗原过剩 IgM抗原过量检测原理 •第一步：在抗原抗体反应过程中得到速率峰值之后，再加入一定浓度的已知抗原，假设进行反应的第一步骤时存在过量的抗体，则额外的抗原溶液会同这些“剩余”的抗体再一次反应，并形成一个新的速率峰，证明在原来反应期间从原有速率峰计算而来的样本结果是可信的•如果在进行第一步时抗原过量，则添加额外抗原不会引起新的免疫沉淀反应，不会出现新的速率峰在这种情况下，样本会进一步自动稀释并重新分析，直到得到最终可信结果 ⑤ 非特异性反应检测•IMMAGE有两种方式:•方式1•方式2 • 在反应开始的90秒内，每隔5秒钟就记录一次，每次记录中进行200次读数, 合计共3600次读数记录特异的信号变化，排除因污染颗粒、气泡及非特异性沉淀物引起的干扰性信号，提高了准确度待测物质浓度待测物质浓度速率峰速率峰12345速率峰与待测物质的示意图速率峰与待测物质的示意图方式1 全程动力学空白对照全程动力学空白对照•设立一个独立的空白对照杯独立的空白对照杯，全程跟踪反应过程, 自动减去空白对照杯中得到的信号，全面排除本底噪音，特别是在测定低稀释度的样本时，更能确保检测结果的可靠性反应杯信号反应杯信号特异性信号特异性信号对照杯信号对照杯信号方式方式 2 •Immage 系统采用空白样本对照，不加入抗体，在另一个比色管中自动检测非特异性反应。
用反应比色管中得到的相应散射信号自动减去从样本空白对照比色管中得到的信号这种处理方法，用速率峰来计算结果就不会受到干扰信号的影响 4、样本自身特性对结果的影响•① 样本与标准品Ig类型的不均一性和Ig分子大小的不均一性影响检测结果•② 样本与标准液中Ig各亚类比例相差过大影响检测结果• •③ 免疫球蛋白异常：•a 多发性骨骨髓瘤，•b 巨球蛋白血症•c 重链病• 免疫球蛋白异常：一方面因浓度过高出现抗原过剩，另一方面因Ig抗原性的改变影响测定结果！ ④、适宜的样本类型：•适用的样本为：人血清、肝素化血浆或 EDTA 血浆，要尽可能新鲜冷冻样本在溶化后无浑浊，不能反复冻溶•尿液和脑脊液样本：尿液和脑脊液样本在测试前必须经过离心沉淀尿液样本不能冷冻•稀释后的样本必须在 4 小时之内测定 • • •⑤、溶血、黄疸和甘油三酯的影响•溶血的影响•甘油三酯的影响•黄疸的影响•⑥、样本中类风湿因子的干扰• 5、实验室条件和操作人员技能•由于测定方法，试剂，仪器和操作人员不同，即各实验室条件不同，会影响测定结果，因此各实验室应建立自己实验室的正常参考值范围。
“检 验 质 量”• 是检验工作者永恒的主题 • 谢 养• 了• 谢 几• 天 。