L/O/G/O基因打靶的里程碑事件基因打靶的里程碑事件——ZFN、、TALEN、、CRISPR-CaS姓名：邢亚迪专业：作物遗传育种导师：何光华 教授 任何对基因进行特异性修饰的工具都是由两个部分组成： 1 DNA特异性识别结合域 2 核酸内切酶活性区域ZFN =DNA识别域域+核酸内切核酸内切酶TALEN =DNA识别域域+核酸内切核酸内切酶CAS9 =DNA识别域域+核酸内切核酸内切酶 ZFN原理原理ZFN=DNA识别域域+核核酸内切酸内切酶DNA识别域：域： 由一系列由一系列 Cys2-His2锌指蛋白（指蛋白（zinc-fingers）串）串联组成（一般成（一般3~4个），每个），每个个锌指蛋白指蛋白识别并并结合一合一个特异的三个特异的三联体碱基核酸内切核酸内切酶：： 非特异性核酸内切非特异性核酸内切酶FokI，形成二聚体，形成二聚体时切割切割双双链DNA TALEN=DNA识别域域+核酸内切核酸内切酶DNA识别域：域： 由一系列由一系列TAL蛋白串蛋白串联组成（一般成（一般20个左右），每个个左右），每个TAL蛋白蛋白识别并并结合一个合一个对应的碱基。
的碱基核酸内切核酸内切酶：： 非特异性核酸内切非特异性核酸内切酶FokI，形成二聚体，形成二聚体时切割双切割双链DNA TALENTALEN的定义及原理的定义及原理 TALE（（Transcription activator -like effectors））: 一种源于植物致病菌的靶向基因操作技一种源于植物致病菌的靶向基因操作技术 科学家科学家发现，来自植物，来自植物细菌菌Xanthomonassp.的的TAL蛋白的核酸蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系关系,一个模一个模块单元元识别一个碱基，一个碱基，简单且特异性极好且特异性极好 通通过组合各合各类模模块，可，可对任意核苷酸序列任意核苷酸序列进行靶向特异性敲除或内行靶向特异性敲除或内源基因的表达源基因的表达调控 目前已在人、大鼠、小鼠、猪、羊、斑目前已在人、大鼠、小鼠、猪、羊、斑马鱼、、拟南芥及酵母等多南芥及酵母等多类物种中得到成功物种中得到成功应用 全全长为34aa的的Tal 蛋白的第蛋白的第12、、13位氨基残基可以特异性位氨基残基可以特异性识别核苷酸碱基核苷酸碱基。
NG可以识别THD可以识别CNI可以识别ANN可以识别G或A通过这种特异性识别，将多个Tal蛋白组装在一起，再加上Fok I核酸内切酶，就可以构成可以识别目的片段的Tale蛋白 TALENTALEN的特异性打靶的原理的特异性打靶的原理：：一对一对可以特异性识别靶基因的可以特异性识别靶基因的TALETALE，定位，定位到需要编辑的基因组到需要编辑的基因组区域；区域；然后然后非特异性核酸内切酶非特异性核酸内切酶Fok1Fok1切断双链切断双链DNADNA从而造成从而造成DNADNA双链断裂（双链断裂（double-double-strand breakstrand break，，DSBDSB）；）；再通过再通过DNADNA的自我修复，引起碱基的缺失或突变，从而引起基因突变的自我修复，引起碱基的缺失或突变，从而引起基因突变Fok1Fok1只有在形成二聚体的时候才有内切酶活性只有在形成二聚体的时候才有内切酶活性 TALENTALEN介导的基因敲除介导的基因敲除TALEN质粒粒对共共转入入细胞后，表达两个融合蛋白，分胞后，表达两个融合蛋白，分别与靶位点特异与靶位点特异结合，由于两个合，由于两个TALEN融合蛋白中的融合蛋白中的FokI临近，形成二聚体，近，形成二聚体，发挥非特异非特异性内切性内切酶活性，在两个靶位点之活性，在两个靶位点之间剪切剪切DNA。
TALENTALEN介导的同源重组介导的同源重组 形成DSB时，同源重组可将需要敲入的序列组合如基因组 TALENTALEN的技术特点的技术特点•任意敲除任意敲除，无基因序列、细胞、物种限制，永久，无基因序列、细胞、物种限制，永久失活失活•成功率高成功率高，在保证转染效率的前提下，有效性可，在保证转染效率的前提下，有效性可达达95%95%以上以上•打靶效率高打靶效率高, ,可完全替代可完全替代RNAiRNAi技术技术•脱靶率低脱靶率低，尚未发现明显脱靶效应，尚未发现明显脱靶效应•周期短周期短，只需按照常规构建质粒方法构建，只需按照常规构建质粒方法构建TalenTalen质粒质粒 CRISPR-Cas系系统•CRISPR序列：序列： 细菌和古细菌中发现的很多成簇的、规律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences）•Cas：： CRISPR相关基因（CRISPR-associated genes）CRISPR-Cas系统是细菌的免疫系统： CRISPR序列能特异性识别外源核酸序列；Cas蛋白的非特异性核酸内切酶功能将外源核酸切断。
两个质粒，一个表达Cas9蛋白，一个表达sgRNA CRISPR-Cas9=DNA识别域域+核酸内切核酸内切酶 DNA识别域域：：向向导RNA 核酸核酸内切内切酶：： Cas9核酸内切核酸内切酶引引导RNA由两部分由两部分组成：成：CRISPR RNA (crRNA)和反式作用CRISPR RNA（transacting CRISPR RNA, tracrRNA)crRNA一端与双一端与双链核苷酸互核苷酸互补结合，另一端与合，另一端与tracrRNA互互补结合，形成向合，形成向导RNA PAM：：NGG•Cas9蛋白与向导RNA结合、组装的动作是这套位点特异性的基因组修饰过程里的限速步骤•PAM序列为 ５’－ＮＧＧ－３’ 靶序列后面必须为ＮＧＧ才能被向导ＲＮＡ识别 CRISPR-Cas系系统靶向要求：靶向要求： PAM序列序列PAM序列只有３个碱基：ＮＧＧ 序列只有３个碱基：ＮＧＧ 靶序列后面必靶序列后面必须为ＮＧＧ才能被向ＮＧＧ才能被向导ＲＮＡＲＮＡ识别在人在人类基因基因组中平均每８个碱基就可以出中平均每８个碱基就可以出现一个ＮＧＧ一个ＮＧＧ 最近有研究发现， crRNA和tracrRNA可以被“改装”成一个向导RNA（single-guide RNA, sgRNA）。
这个sgRNA足以帮助Cas9内切酶对DNA进行定点切割而且可以将sgRNA和Cas9装在同一个表达质粒中表达 这种RNA介导的Cas9酶切作用能够在多种类型的细胞和生物体内正常地行使功能，在完整基因组上的特定位点完成切割反应 CRISPR-Cas系系统优势•ZNF成本高昂，效率低•Cas9的效率是TALEN的5倍•sgRNA全长不超过100bp，构建更容易 L/O/G/OThank You! 。