艾滋病阳性产妇分娩婴幼儿 早诊标本的采集 滤纸片干血斑技术 罗玉珍 桂林市妇女儿童医院检验科 20142014年年3 3月月2020日日 1 1 概述 n滤纸片是血液标本采集和运输的极好载体 n全血滴在滤纸片上制成滤纸片干血斑（Dried blood spots，DBS） ，有很好的生物稳定性 和安全性，便于储存和运输 n特别适用于发展中国家边远地区的样本采集、 贮存与运输 n1973年，国外就开始研究用滤纸收集血样用于 疾病的研究 20142014年年3 3月月2020日日 2 2 概述 n国家艾滋病参比实验室 （NARL）从2004年开 始，应用滤纸片干血斑 检测HIV-1抗体、DNA 、基因分型与病毒载量 测定等方面的研究 20142014年年3 3月月2020日日 3 3 HIV感染产妇所生婴幼儿HIV抗体 检测策略及流程 n适用范围 ●HIV感染产妇所生婴幼儿； ●已满18个月的儿童，其母亲HIV感染状态不详，儿童出现 HIV相关临床表 ●临床怀疑HIV感染的儿童 n儿童HIV/AIDS的诊断 n>18M的儿童先用ELISA初筛，再用WB确诊 n<18M婴儿检测HIVRAN前DNA或HIV抗原（P24）或病毒 培养 20142014年年3 3月月2020日日 4 4 HIV阳性母亲所生、未受感染的婴儿 母 亲抗 体 V L 婴儿月龄 抗体阳性率% 20142014年年3 3月月2020日日 5 5 HIV阳性母亲所生、在宫内或产道受感染的婴 儿 母亲抗体 婴儿抗体 V L 抗体阳性率 % 婴儿月龄 20142014年年3 3月月2020日日 6 6 婴儿月龄 HIV阳性母亲所生、产后因哺乳受感染的婴 儿 母亲抗体婴儿抗体 抗体阳性率% V L 20142014年年3 3月月2020日日 7 7 艾滋病感染孕产妇所婴幼儿HIV感染早期诊断检测及服务流程 20142014年年3 3月月2020日日 8 8 概述 n目前国际上最常用：Whatman903滤纸干血斑采 集卡。
n该卡是Whatman(沃特曼)公司特制的棉花制片 由美国疾控中心批批检合格后上市，被WHO等国 际组织公认为采集血样的最佳载体 nFTA（干血点采样） 20142014年年3 3月月2020日日 9 9 物品准备 n耗材储物柜：干燥、整洁、安全、方便取用 ，存放样本制作所需的相关耗材 n耗材： • 无粉手套 • 干燥架 • 药棉或棉签和纱布 • 采血针 • 滤纸采血片、信息卡 • 污物桶 20142014年年3 3月月2020日日1010 样品采集 n填写滤纸卡：信息完整，以免混淆样品 n确定采血部位： 脚后跟采血法： 6周~4月或小于5kg 的婴儿 脚大拇指采血法： 4~10月或 5~10kg的婴儿 手指尖采血法：大于10月或大于10kg 的婴儿 静脉采血法 20142014年年3 3月月2020日日1111 样品采集 温育采血部位 ：不超过41℃ ，3~5分钟 酒精消毒，用 无菌纱布垫擦 干 针刺，无菌纱 布垫擦去第一 滴血 用滤纸蘸取单 个血滴，让血 滴充分浸润采 血圈至少采 集3个采血圈 20142014年年3 3月月2020日日1212 样品采集 n血样采集完毕后，将制成的滤纸片干血斑采 集卡在干燥、清洁、平整、无吸水性的桌面 放置3~4小时风干。
或将采集卡放置于专 业纸质干燥架上自然风干 n不要放在太阳下晾晒或用任何人工方法（如 烘干机）加速干燥 n静脉采血：用移液器移取80μL全血，对准 采样圈中心缓慢将血液滴加在滤纸 上，避 免气泡产生 20142014年年3 3月月2020日日1313 DBS有效性的判断 n有效样品 n无效样品 样本量 不足 样品未 干 血斑粘 连过度 血斑褪色、 污染 出现血清 环 血斑分层 20142014年年3 3月月2020日日1414 DBS保存 n样品风干后，将每张滤纸片 采集卡分别装入薄玻璃袋 n装好后放入封口袋，多个薄 玻璃袋可以装入一个封口袋 ，同时放进干燥剂和湿度卡 n轻轻将封口袋的空气积压出 去，封口 n冷藏干燥－20℃保存 20142014年年3 3月月2020日日1515 DBS递送 nDBS采集卡可以专人送样或通过邮寄 n将采集卡和送检单一同放入大信封邮寄前 再次核对送检单与样品是否相符 n要写明采样点的联系方 式：采样点名称、送样 人、送样日期、结果反 馈地址//等 20142014年年3 3月月2020日日1616 DBS的质量控制 n未采血的滤片应放置在干燥处保存，滤纸表面必 须保持清洁，不能与手、奶、消毒液、清洁剂、 水等物质接触防止污染。
n滴在采血圈内的血液，必须从正面吸入并渗透到 滤纸背面正反面的血斑直径要求一致避免正 反两面滴血及采集有大量组织液的血液或凝固的 血液避免血斑血量不足，渗透不够，而出现梅 花状、夹心状和直径＜8mm血斑 20142014年年3 3月月2020日日1717 DBS的质量控制 n合格血斑的六条标准是 ①每个血斑直径要达到10mm； ②同时取3个血斑 ； ③血液必须完全渗透到滤纸背面； ④无重叠； ⑤无污染； ⑥易洗脱 n采集好的血斑标本应按要求保存，避免因保存不当造 成血标本固化于滤纸上，检测时被测物洗脱不下或部 分洗脱，出现假阴性结果而漏诊 20142014年年3 3月月2020日日1818 DBS在HIV检测中的应用 n以下数据引自中国CDC性艾中心网页 1、HIV抗体检测 2、HIV-1前病毒DNA检测， 3、HIV-1基因序列测定和亚型分析 nHIV抗体检测： • 相同血样的滤纸片干血斑样本与血浆样本用EIA法检测，符合率为 100%，相关性为0.919 • 两种样本经WB确认，条带完全一致的占总数的42.85%,其中主 要条带（至少有2条env带出现，或至少1条env和p24带同时出现 ）的符合率为100% 20142014年年3 3月月2020日日1919 DBS在HIV检测中的应用 nHIV-1前病毒DNA检测： • 采集了59例静脉吸毒HIV-1感染者的DBS血样 和22例HIV-1阴性健康人EDTA抗凝静脉全血 5ml，保存全血1ml，另用50μl制备干血斑样 本后，分离血浆。
• 结果发现，59份DBS样本HIV-1 感染基因诊断 敏感度93% ；22份全血样本94%，χ2检验显 示，两种样本用于HIV-1 基因诊断时无统计学 显著性差异 • 22份两种阴性样本特异性均为100% • 18对全血和DBS样本HIV-1基因诊断一致性分 析，符合率94% 20142014年年3 3月月2020日日2020 DBS在HIV检测中的应用 nHIV-1基因序列测定和亚型分析： • 研究采集了20例静脉吸毒HIV-1感染者的 EDTA抗凝静脉全血2ml， 50μl制备干血斑样 本 • 结果发现，干血斑样本与全血样本DNA PCR产 物亚型分析一致，氨基酸序列比对同义和非同 义替换比例、位置和类型基本一致 20142014年年3 3月月2020日日2121 DBS在HIV检测中的应用 n婴幼儿早期诊断 n新发感染的检测 n病毒载量检测 n耐药性分析 n能力验证（PT） 20142014年年3 3月月2020日日2222 Thang you! 20142014年年3 3月月2020日日2323 。