植物染色体的标本制备目前，国内外常用的植物染色体制片技术可以分为两种，即压片技术和去壁低渗技术Belling(1921)提出植物染色体压片技术后，压片已成为植物染色体争论中最广泛应用的常 规技术；但是由于植物细胞有坚实的细胞壁，染色体很难象动物染色体那样平坦地贴在载玻 片上，Omura 和 Kurata(1978)把植物原生质体技术应用到水稻染色体争论之中，用纤维素酶、果胶酶和0.075mol.L-1氯化钾处理取得了肯定的进展，陈瑞阳等人〔1979、1982〕提出了植物染色体标本制备的酶解去壁低渗技术，并在多种植物上得到广泛应用，成为当今植物 染色体争论中的重要方法压片技术和去壁低渗技术在取材和预处理要求及其操作都是一样 的，即两者的材料根底条件是一样的，但它们所承受的染色体分散方法是不同的压片法是 以人工外加机械压力使染色体分散，而去壁低渗法是用酶分解细胞壁，低渗液使细胞膜吸胀、 水外表张力使染色体分开两种技术各有其优缺点，前者操作快速简便、省材省时，后者染色体易于开放、且真实不变形，尤其是对成熟细胞多的植物组织，如芽、愈伤组织等材料有 独到效果，本试验主要介绍去壁低渗染色体制片技术。
一、试验原理植物根尖的分生细胞的有丝分裂，每天都有分裂顶峰时间，此时把根尖固定，经过染色和压片，再置放在显微镜下观看，可以看到大量处于有丝分裂各时期的细胞和染色体二、试验目的根尖染色体压片法，是观看植物染色体最常用的方法，也是争论染色体组型、染色体分 带、染色体畸变和姊妹染色单体交换的根底学习醋酸洋红染色的具体操作方法，把握植物 有丝分裂制片技术，通过大量的制片观看，能比较快速准确地推断细胞有丝分裂前、中、后、末期的染色体图象，并对其典型制片照像三、试验材料大蒜〔Aillumsativum〕、洋葱〔Aillumcepa〕的鳞基或蚕豆〔Viciafaba〕的种子四、试验内容1、植物染色体制片技术训练，独立完成植物根尖、茎尖及幼叶的取材、预处理、固定、制 片、染色等染色体制片全过程，并获得图象清楚、完整、高度分散的染色体典型图象制片； 2、染色体显微照相技术训练，用生物摄影显微镜，摄制某资源植物种典型的染色体图象 照片 40 张，并从中选择确定清楚的图片；3、细胞有丝分裂典型时期识别技能训练，通过大量的染色体图象观看，能比较快速准确地推断细胞有丝分裂前、中、后、末各个时期的五、试验器具和药品1、设备：一般生物显微镜、NIKON 数码摄影显微镜、数码相机及打印机、培育箱、恒温水浴锅；载玻片、盖玻片、镊子、不锈钢剪刀、单面刀片、磨口三角瓶、移液管、棕色〔200ml〕、凹型孔白瓷板、玻璃板、烧杯(200ml)、天平、电炉、染色缸、扩大镜、游标卡尺、滤纸片、玻片标签纸、小台秤〔200g〕、量筒〔10ml、50ml、100ml、1000ml〕容量瓶〔1000ml〕、滴瓶、滤纸、牙签、切片盒等；2、药品及配制8－羟基喹啉、秋水仙素、KCl、甲醇、冰乙酸、对二氯苯(白色结晶，有樟脑气味、密封保存、对中枢神经有抑制作用 )、α-溴萘、NaCl、KH PO 、Na HPO 、甘油、HCl、CaCl 、醋酸2 4 2 4 2洋红、45%醋酸、卡宝品红等试剂。
试剂配制：0.002mol.L-1 8－羟基喹啉〔染料中间体〕配制：取 8-羟基喹啉 0.029g，先用少许乙醇溶解， 用鲜蒸馏水定溶 100ml0.01%秋水仙素配制：称取 1g 秋水仙素，用少许乙醇溶解后，用鲜蒸馏水定溶至100ml⑶饱和对二氯苯溶液配制：鲜配鲜用，称取 5g 对二氯苯结晶，用 40-45℃蒸馏水 100mL 溶解，振摇 5min，静置 1 h，取上清液，10-20℃下预处理0.075mol.L-1KCL 溶液配制：称KCL 5.592g，加少许鲜蒸馏水溶解后，定溶至1000ml⑽45%醋酸溶液配制：95%冰乙酸，稀释成 45%浓度所需浓度〔45%〕=冰乙酸体积／溶液体积=45ml 冰乙酸×0.95／〔45+50〕0.1mol.L-1 盐酸溶液配制：用移液器取浓盐酸0.85ml，加蒸馏水至 100ml浓盐酸的质量分数为 36.5%1：250ml 溶液中含HCL 为0.25＊0.1＝0.025mol2： Hcl 的摩尔质量为 36.5g／mol那么需Hcl 的质量为 0.025*36.5＝0.9125 克3：算出总共需要浓盐酸的质量为：0.9125／0.365＝2.5g4：密度为 1.18g/mL 那么需要浓盐酸的体积为2.5/1.18=2.12〔毫升〕铁醋酸洋红染液配制：先将 50 mL 45%的醋酸水溶液放入 150mL 的锥形瓶中煮沸，然后移去火源，渐渐地参加 0.5-1g 洋红粉末〔留意不要一下倒入，以防溅出〕，过 1-2min 后，参加一锈铁钉，再过几分钟后取出铁钉〔使染色剂略含铁质，以增加染色性能〕，连续用微火加热 1h 后，冷却过滤，即可使用，保存于棕色瓶中〔避开阳光直射〕。
如无洋红也可用地衣红代替，配制方法同前此液常用于植物细胞核，特别是花粉母细胞的涂抹和压碎法染色，效果良好卡宝品红〔Carbor fuchsin〕试剂〔石碳酸品红〕的配制: 称 3g 碱性品红，溶于 100ml70% 的乙醇中，称为 A 原液〔此液可以长期保存〕，取 10mlA 液，参加 90ml15%的石碳酸溶液〔两周内使用〕，称为 B 原液使用前，取B 原液 10ml，参加 90ml45%的醋酸和 1.8 克山梨醇，充分溶解后备用此液适用于植物核型分析、染色体形态观看六、试验步骤1、取材一般来讲，但凡能进展细胞分裂的植物组织或单个细胞，都可以作为染色体制片材料； 如根尖、茎尖、幼花、幼叶、幼胚、愈伤组织及正在分裂的大、小孢子母细胞等；正确取材就是强调取材部位肯定要准确，取材数量肯定要少而精、切忌多而杂，材料颖、尽可能是 活材料先将种子浸泡 1 天，待吸水膨胀后移到铺有几层吸水纸的培育皿内，上面盖两层湿纱布加不少许，置于 1820 ℃〔黑暗〕培育4050 小时待根长至 12cm 时，于上午 10 时左右剪取⑴根尖用能见根冠的根尖材料作为试验材料比较适宜；植物根尖不同部位的细胞，其分裂细胞 频率有明显的差异；根冠是由不同分化程度的薄壁细胞组成，且常含淀粉粒，根冠细胞已经 停顿细胞分裂，染色体制片时应当切除根冠；但因根冠很简洁识别，且根冠后 1-2mm 长的根段就是根尖分生区细胞，所以，根冠是确定根尖分生细胞区的重要标志；染色体制片时，比较重视能见根冠的根尖材料作为试验材料比较适宜。
根尖分生细胞区多为等直径的分裂细 胞，其细胞质浓，细胞核大、细胞核体积约占整个细胞体积的 3/4，是染色体制片的好材料； 染色体制片取材假设不是在根尖分生细胞区取材，即使制片全过程每一环节都作得很好，也 是徒劳的根尖分生区上端是伸长区，该区的细胞主要是细胞体积增加，根本上已停顿分裂所以，根尖染色体制片的取材部位是根冠末端 1-2mm 的根段为宜以洋葱为例，根冠区约0.5mm，分生区 1－2mm，3mm 之后为伸长区〔图 9-1〕物种不同根冠及分生区的长度也不同，一般而言，用于染色体制片的根尖长度，以根冠末端1-2mm 为宜图 9-1 洋葱跟尖纵切面，各局部细胞分裂的频率差异植物体细胞染色体的争论中，根尖分生组织是主要的染色体制片材料；由于它取材便利， 分生区易于区分，假设用种子发芽取根，还不受季节的影响，这是其他材料所不及的根尖 材料获得的方法很多，常有种子发芽、鳞茎水培、扦插取根、引发气生根等①种子萌发取根：生长强健的根尖不仅细胞分裂频率较高，而且染色体形态也比较平直， 也就是所谓的“硬染色体”；而根尖生长势差的材料，不仅细胞分裂频率低，而且染色体形态也多是扭曲的，也就是所谓的“软染色体”。
所以，种子萌发取根，不仅要求种子的饱满 度、生活力等品质性状好之外，还要求种子萌发条件最正确，获得最正确的“硬染色体”②鳞茎水培：洋葱、水仙、蒜、风信子等材料多用此方法；在水培过程中，留意常常更换颖的同温水，是获得良好材料的关键③扦插取根：杨、柳、桑、葡萄、菊花等扦插生殖植物多用此方法；在扦插生殖过程中， 留意保湿通气，可以获得良好的根尖材料⑵茎尖用能见生长锥的茎尖材料作为试验材料比较适宜；茎尖一般包括有生长锥和叶原基两部 分，广义上讲的芽，还包括有幼叶和腋芽原基生长锥是茎的顶端分生细胞组织区，不同植物或同一植物的不同发育阶段，其生长锥的大小和外形都有较大的变化，他们可以是下凹、园丘、园锥或极端伸长〔如禾本科〕等多种不同的外形；生长锥的宽度，因物种不同也不同； 丁香生长锥宽度<40μm，苏铁生长锥宽度达 300μm生长锥不同部位的细胞，其细胞分裂的频率及细胞周期长短有明显的差异一般来讲，生长锥则面的叶原基细胞比生长锥中心区 细胞的分裂周期短一倍左右；如曼佗罗生长锥中心区及叶原基区细胞分裂周期分别为 76、36h，菊花生长锥中心区及叶原基区细胞分裂周期分别为140、70h也就是说，生长锥则面 的叶原基细胞也是染色体制片取材的好材料。
茎尖取材以生长锥顶开头 1.0-1.5mm 为宜，休眠芽不宜用作染色体制片的材料茎尖取材工作是比较繁复的，需要细心地剥掉全部幼叶， 用扩大镜观看，能见生长锥时方可〔图9-2〕9-2 茶叶叶芽纵切面图物种不同，生长锥的外形及宽度，因物种不同也不一样，且易受季节影响；所以，茎尖取材技术难度比根尖取材技术要高茎尖的正确取材，更需要强调取材部位肯定要准确，取 材数量肯定要少而精、切忌多而杂，应在扩大镜下，尽可能地剥除幼叶、尽可能地削减木质 分子结晶的干扰2、预处理⑴目的及作用：植物有丝分裂中期染色体高度浓缩，形态和构造都比较清楚，但因纺垂体的 作用，染色体严密地排列在赤道板上，很难将其分开,尤其是染色体数目较多的植物材料， 很简洁产生染色体严峻重叠；而且因细胞分裂中期维持的时间短，一般仅 10-30min，使中期染色体细胞消灭频率不高为了抑制上述冲突，常用化学或物理方法对材料进展预处理这些方法的作用机理及其作用是：①阻挡或破坏纺垂体微管的形成，由于没有纺垂体的作用，细胞有丝分裂过程，被阻抑在细胞分裂中期阶段，从而累计比较多的处于细胞分裂中期的染 色体图象②促进染色体浓缩变短，削减染色体之间相互缠绕重叠，有利染色体的高度分散。
③转变胞质粘度，促进染色体清楚，促进细胞质清洁所以预处理是否适宜，是染色体制片技术中最关键的操作步骤；假设预处理的效果良好，即使是初学者也不难制作出优良的染色 体标本，反之，假设预处理失败，即使是很有阅历的人也难以制作出好的制片⑵处理药剂可以用作染色体预处理的化学药品，主要有生物碱、甙类、酸类及其他物质；最常用的化学药品有秋水仙素、8－羟基喹啉及对二氯苯①秋水仙素〔Colchicine〕：是从石蒜科秋水仙素属秋水仙(Colchicumautumnale)种子或鳞茎中提取的一种生物碱，其分子式为 C22H25NO6+1.5H2O，分子量为 399.45纯秋水仙素为针状结晶，商品多为白色或淡黄色粉末,融点 155℃，易溶于水、酒精、氯仿及甲醛中,但在热水中的溶解度差，不溶于苯剧毒,易引起眼睛失明或中枢神径麻醉，使用时肯定要要留意安全秋水仙素预处理的有效浓度为0.001-1%，常用浓度为 0.05-0.2%②8－羟基喹啉〔8-hydroxyquinoline〕：白色结晶或粉末, 其分子式为HO8H3N：CHCH：CH，分子量 145.17溶于酒精，难溶于水,需 60℃、2－3h 才完全溶解8－羟基喹啉不仅具有秋水仙素的预处理的效果，而且所显示的染色体缢痕及随体的构造，往往比秋。