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1、第四章 生物化学与分子生物学技术实践知识系统构建必背要语拼十年寒窗挑灯苦读不畏难；携双亲期盼背水勇战定夺魁。如果你希望成功，以恒心为良友，以经验为参谋，以小心为兄弟，以希望为哨兵。1.分离与测定生物成分中蛋白质的技术包括离心沉降法、薄膜透析法、凝胶色谱法和电泳法等。2.离心沉降法是通过控制离心速度，使分子大小、密度不同的蛋白质发生沉降分层，从而达到分离出不同种类蛋白质的目的。3.薄膜透析法是利用蛋白质分子不能透过半透膜的特性，使蛋白质与其他小分子化合物分离开。4.凝胶色谱法是根据蛋白质分子量的大小差异对其进行有效分离的方法。5.芳香油挥发性强、易溶于有机溶剂，因此可以采用蒸馏法、萃取法、压榨法
2、等进行提取。水蒸气蒸馏法是植物芳香油提取的常用方法。对于不适于蒸馏的原料可以采用萃取法。6.PCR扩增过程中要进行无菌操作，避免污染，且向离心管中加入模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸以及TaqDNA聚合酶。7.变性是在94 高温下使模板双链DNA解旋。8.退火是将反应体系温度降至55 ，使引物与模板DNA链配对。9.延伸是将反应体系温度回升至72 左右，在TaqDNA聚合酶作用下，使引物链延伸，形成互补的DNA双链。10.DNA分子的测定：DNA分子二苯胺试剂蓝色物质。规律方法整合整合一蛋白质的分离与纯化1.薄膜透析法(1)破碎细胞方法：研磨与超声波结合的方法。(2)血红蛋白的释放：使红细胞破
3、裂释放血红蛋白。(3)透析目的：除去样品中的小分子杂质。原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。2.离心沉降法离心沉降法也是纯化蛋白质的一种方法，它通过控制离心速率，使得分子大小、密度不同的蛋白质发生沉降分层，从而达到分离出不同种类蛋白质的目的。3.醋酸纤维薄膜电泳法(1)原理：不同的物质在同一电场中的泳动速度不同。(2)影响因素：泳动速度主要取决于带电颗粒的性质，即颗粒的大小、形状和所带净电荷的多少。一般来说，带电颗粒直径越小，越接近于球形，所带净电荷越多，则在电场中的泳动速度越快；反之，则越慢。此外，电场强度、溶液的pH等因素对泳动速度也有影响。(3)优点：简单、快速、分离清
4、晰、灵敏度高、样品用量少、没有吸附现象、电泳后区带界限清晰等优点。4.凝胶色谱法根据蛋白质分子量的大小差异对其进行有效分离的方法。(1)相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢。(2)相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。例1试回答下列“蛋白质提取与分离实验”的有关问题：(1)为了提取和分离血红蛋白，首先对红细胞进行洗涤以去除杂质蛋白，洗涤时应使用生理盐水而不使用蒸馏水的原因是 。(2)若要去除血清蛋白中的小分子杂质，采用图1装置。透析液是
5、 ，一段时间后，若向烧杯中加入双缩脲试剂，透析袋内溶液是否出现紫色？并说明判断的依据： 。(3)图2、图3分别表示电泳法分离蛋白质和纸层析法分离叶绿体中色素的结果。不同蛋白质得以分离是因为 ；不同色素得以分离是因为 。答案(1)防止红细胞吸水破裂(2)(磷酸)缓冲液出现紫色。双缩脲试剂可以透过半透膜，与袋内血清蛋白反应，生成紫色物质(3)不同蛋白质所带电荷性质、分子大小和形状不同，导致电泳时迁移速度不同不同色素在层析液中溶解度不同，导致层析时扩散速度不同整合二提取芳香油的方法1.植物芳香油的提取方法有蒸馏法、压榨法和萃取法等。2.水蒸气蒸馏法是植物芳香油提取的常用方法，它的原理是利用水蒸气将挥
6、发性较强的植物芳香油携带出来。例2下列关于植物芳香油提取方法的叙述，正确的是()A.提取植物芳香油利用蒸馏法出油率最高B.出油率的高低完全取决于采用的方法C.各种芳香油的提取都适合用蒸馏法D.提取植物芳香油具体采用哪种方法要根据原料的特点来决定答案D解析植物芳香油的提取方法有蒸馏法、压榨法、萃取法等，具体采用哪种方法，要根据植物原料的特性来决定。挥发性强，并在蒸馏过程中有效成分不被破坏的宜用蒸馏法提取；挥发性较差的，受热时有效成分易分解的宜用萃取法；原料易焦糊的宜用压榨法提取。出油率的高低不仅与提取方法有关，而且与实验过程的操作、原料的处理等方面有关，因此A、B项错误。水蒸气蒸馏法，由于设备简
7、单，操作容易，是提取植物芳香油的常用方法，但不是所有芳香油的提取都适合用此法，因此C项错误。整合三PCR技术1.PCR的原理(1)变性：当温度上升到94 时，双链DNA解旋为单链(如下图)。(2)退火：系统温度下降至55 左右时，两种引物通过碱基互补配对原则与两条单链DNA结合(如下图)。 (3)延伸：当系统温度上升至72 左右时，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、G、C)在TaqDNA聚合酶的作用下，依据碱基互补配对原则合成新的DNA链(如图)。2.PCR反应的结果(1)PCR一般要经历三十多次循环，每次循环都可以分为变性、退火、延伸三步。 (2)两个引物之间的固定长度的DNA序列呈指数扩增。
8、3.特别说明(1)DNA复制需要引物的原因：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3端延伸DNA链。PCR中，引物长度通常为1540个核苷酸。(2)DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸。(3)当PCR反应体系的温度由变性后冷却到55 左右时，引物与模板可结合，一般不需考虑解开的两个DNA模板链的重新结合。(4)在进行PCR扩增后，若以一个DNA片段为模板，经n次循环后DNA数为2n；若以N个DNA片段为模板，经n次循环后DNA总数为N2n。例3下图a、b、c均为PCR扩增的DNA片段，下列有关说法正确的是()A.片段a、b、c的长度均相同B.片段a、b只是第一次循环的产物C.片段c
9、最早出现在第二次循环的产物中D.经过30次循环后，片段c的数量为230答案C解析图中片段a、b只有一种引物， 是由原始DNA链为模板复制而来，其长度比片段c长，A项不正确；由于原始模板在每次循环中均可作为模板，则每次循环都能产生图中片段a、b，B项不正确；由于第一次循环的产物只有一种引物，而图中片段c有两种引物，则最早出现在第二次循环，C项正确；经过30次循环后，得到的DNA片段总数为230，这包括图中的片段a、b，故D项不正确。热点考题集训1.细胞破碎后，各种蛋白质就会释放出来，再根据蛋白质的不同特性进行抽提。下列关于蛋白质抽提的措施中，不正确的是()A.酸性蛋白质可用偏碱性溶液抽提B.水溶
10、性蛋白质可用透析液(中性缓冲液)抽提C.脂溶性蛋白质可用有机溶剂抽提D.碱性蛋白质可用强酸性溶液抽提答案D解析抽提蛋白质的基本原理是根据蛋白质的物理性质，加入不同的试剂后，使蛋白质溶于试剂中而抽提蛋白质。强酸、强碱都会使蛋白质变性而沉淀。2.下列有关透析的叙述，错误的是()A.用于透析的薄膜要具有选择透过性B.透析膜是一种半透膜C.透析能使小分子自由出入，而将大分子保留在袋内D.透析膜可用于更换样品的缓冲液答案A解析透析膜能使小分子自由出入，大分子不能通过，具有半透性，但不具有选择性，生物膜上因有特异性载体而具有选择透过性。透析过程中小分子可自由出入，因此，可用于更换样品的缓冲液。B、C、D项
11、都正确，A项错误。3.如图是人血清蛋白在以醋酸纤维薄膜为支持物，pH为8.6的巴比妥缓冲液中电泳分离结果示意图，由此图不能得出的结论是()A.在pH为8.6的巴比妥缓冲液中、2、1和清蛋白都带负电荷B.在pH为8.6的巴比妥缓冲液中电泳时，、2、1和清蛋白迁移速率不同C.球蛋白的相对分子质量一定比球蛋白的相对分子质量大D.在pH为8.6的巴比妥缓冲液中球蛋白迁移速率最慢，清蛋白迁移速率最快答案C解析带电粒子在电场中迁移的速率是带电粒子带电性质、带电量、粒子大小、粒子形状共同作用的结果。4.PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比，主要有两点不同，它们是()PCR过程需要的引物一般是人工合成的单链
12、DNAPCR过程不需要DNA聚合酶PCR过程中 DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的PCR过程中，DNA不需要解旋，直接以双链 DNA为模板进行复制A.B.C.D.答案C解析PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比较，主要有两点不同：(1)PCR过程需要的引物一般是人工合成的单链DNA，长度通常为1540个核苷酸。(2)PCR过程中，DNA解旋不依赖解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的。5.将经处理破裂后的红细胞混合液以2 000 r/min的速度离心10 min后，离心管中的溶液分为四层，从上到下的顺序依次是()A.血红蛋白层、甲苯层、脂溶性物质层、杂质层B.甲苯层、
13、杂质层、血红蛋白层、脂溶性物质层C.脂溶性物质层、血红蛋白层、甲苯层、杂质层D.甲苯层、脂溶性物质层、血红蛋白层、杂质层答案D解析混合液经离心后，按密度大小排列，在离心管中从上到下的顺序依次是：第1层为无色透明的甲苯层；第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质层；第3层为红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液；第4层为暗红色沉淀物，主要是红细胞破碎物沉淀。6.下列关于DNA聚合酶催化合成DNA子链的说法中，正确的是()A.以DNA为模板，使DNA子链从5端延伸到3端的一种酶B.Taq DNA聚合酶必须在每次高温变性处理后再添加C.DNA聚合酶能特异性地复制整个DNA的全部序列D.Taq DNA聚合酶是从
14、深海中的某种菌体内发现的答案A解析DNA聚合酶不能从头开始催化合成DNA，引物的5端与母链发生碱基互补配对，然后从引物的3端延伸子链，所以，整条子链的合成是从5端延伸到3端；Taq DNA聚合酶能耐高温，所以在反应体系中可反复利用，无需另外再添加；PCR扩增的是引物之间的固定长度的DNA序列；Taq DNA聚合酶是1966年从美国黄石公园的一个热泉内的某种菌体内发现的。7.在植物有效成分的提取过程中，常用萃取法、蒸馏法和压榨法，下列关于这三种方法的叙述错误的是()A.蒸馏法和萃取法都需要水浴加热B.压榨法适用于易焦糊原料的提取，如柑橘、柠檬等C.萃取法适用范围较广，一般原料颗粒小、萃取温度高、时间长，萃取效果好D.蒸馏法适用于提取玫瑰油、薄荷油等挥发性强的芳香油答案A解析蒸馏法适用于提取挥发性强的芳香油，其操作过程中不需要水浴加热，萃取法需要水浴加热。8.下列关于玫瑰精油和橘皮精油提取的过程，叙述正确的是()A.玫瑰精油和橘皮精油都可用蒸馏、压榨和萃取的方法提取B.在水蒸气蒸馏出的玫瑰乳浊液中加入无水Na2SO4的目的是除水C.新鲜的橘皮中含有大量的果蜡、果胶等
