第二章 微生物的膜囊泡和纳管系统,课时：4 学时 授课方式：讲授+讲座 开课时间：2014年秋季,主要内容,,革兰阴性菌的细胞壁复合体,细菌膜囊泡的产生和组成,研究膜囊泡的方法,细菌纳管的意义,膜囊泡的功能,细菌纳管的特征,微生物的膜囊泡,Membrane Vesicle (MV),革兰阴性菌的细胞壁复合体,Brock Biology of Microorganism,2010,革兰阴性菌细胞壁,细胞壁 复合体,外膜,内膜,薄层肽聚糖,膜周间隙,特殊跨膜结构,,磷脂和脂蛋白,糖脂,磷脂双分子层,,细菌膜囊泡的产生和组成,Kuehn,2005, Gene & Development,细菌膜囊泡的产生,常见的细菌,铜绿假单胞菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌、大肠埃希菌等,膜囊泡,自发地、持续地产生 直径20-300nm,组成,球型双层膜结构 膜囊泡中包含蛋白质、磷脂、脂多糖（LPS）和肽聚糖等成分,膜囊泡组成,From Bas, 2013,定量蛋白质组技术: 膜囊泡含有H结合蛋白、脂蛋白、细胞结合因子、纤毛成分、LPS组合蛋白，每种膜囊泡都含有外膜蛋白A，说明膜囊泡由外膜形成,细菌膜囊泡的产生和组成,细菌膜囊泡 vs. 细菌外膜,－相似，但不完全等同,富含HtrA丝氨酸蛋白酶,膜囊泡：,富含黏附分子SabA和SabB,细菌外膜：,例：幽门螺杆菌,细菌膜囊泡的产生和组成,细菌膜囊泡产生,当外膜生长超过肽聚糖或当肽聚糖生长超过外膜时形成～,细菌膜囊泡的产生和组成,膜囊泡细胞壁复合体成分相互作用,喹诺酮类信号分子被包入内源产生的膜囊泡中，这个泡状体可以在不同细胞间穿梭传递信息，进而介导细菌群体行为,细菌细胞壁应激反应,温度、pH、养分改变及噬菌体感染等均可引发细菌应激反应,“双层耦合”模型,细菌膜囊泡产生,---Case I 细菌细胞壁应激反应,添加IPTG形成胁迫，细菌外膜形成囊泡,细菌利用膜囊泡，包裹自身胞内物质、蛋白、信号分子等，传送至其它细菌表面,McBroom, 2007, Molecular Microbiology,细菌膜囊泡的产生和组成,IPTG：诱导剂，异丙基硫代半乳糖苷,发现由30-60nm宽，最长5μm的膜囊泡构建细菌间网络结构，通过网络传递膜蛋白和信号分子,Jonathan, 2014, Environmental Microbiology,目前尚没有一种模型能解释膜囊泡产生的全部机制,细菌膜囊泡产生,---Case II,细菌膜囊泡的产生和组成,－体积较小 －浮力密度较轻,去除细胞碎片、杂质,密度梯度离心,梯度离心管,亲和层析法,抗体亲和磁珠纯化,膜囊泡的物理特征,研究膜囊泡的方法,培养细菌,Brooke, 2012, Infection and Immunity,小囊泡的产生,当外膜蛋白-肽聚糖层，或外膜蛋白-肽聚糖层-内膜的密度减少时，特别是OmpA、LppAB锚定于细菌外膜但是没有与细菌肽聚糖层锚定，细菌表面或横隔部位会出现膜囊泡,区别： 小囊泡包含LPS蛋白和胞内物质 大囊泡只含膜蛋白成分,大囊泡的产生,Case: 细菌,微生物膜囊泡的功能,Brooke, 2012, Infection and Immunity,Case: 古菌,古菌膜囊泡的产生属于主动脱落，亦称脱落膜囊泡 受体内多种酶调控，如：钙蛋白酶、翻转酶、混杂酶、凝溶胶蛋白等控制 古菌膜囊泡受内体蛋白分选转运装置(ESCRT-III )和液泡分选蛋白(Vps4)调控,William, 2012,Cell,,,微生物膜囊泡的功能,Brooke, 2012, Infection and Immunity,与古菌相似，真菌(寄生虫)膜囊泡都为脱落膜囊泡 受内体蛋白分选转运装置(ESCRT-III ) 调控,形成过程：首先形成腔内小泡(ILV)在内体蛋白分选转运装置作用下形成核内体(MVB)后，运输到外膜表面。
MVB与外膜融合后，作为外泌体(Exosome)释放,,,Case: 真菌,膜囊泡的功能,Brooke, 2012, Infection and Immunity,膜囊泡的多种功能 (A) 促进细胞表面荚膜多糖的分泌 (B) 促进细胞与细胞间的交流，如细菌释放群体感应分子；古菌分泌抗生素 (C) 致病性微生物的膜囊泡能够直接向宿主释放毒力因子，如致病毒素,,,,(A),(B),(C),膜囊泡的功能,Brooke, 2012, Infection and Immunity,膜囊泡的多种功能 (D)膜囊泡可以通过LPS/脂蛋白选择，能够刺激先天免疫系统 (E)膜囊泡属于抗原结构当病毒感染活体细胞后，膜囊泡将修复信息传递至T淋巴细胞 (F)通过膜囊泡携带的抗原，T淋巴细胞与B淋巴细胞会触发机体自适应免疫,,(D),,(E),,(F),膜囊泡的功能,细菌膜囊泡产生,－浓缩、包装、携带、转运多种细菌毒力因子和活性物质 －宿主细胞和膜囊泡的相互作用，诱发免疫反应 －通过传递遗传物质和活性蛋白促进细胞-细胞间的交流 －促进细菌生物膜的形成与稳定,细菌膜囊泡的功能,微生物的纳管系统,Bacterial Nanotube,细菌纳管的发现,细菌间信息交流与物质交换的途径与方式 －细菌群体感应系统（Quorum Sensing，QS） －性菌毛结合（Conjugation） －噬菌体转导 －膜囊泡（Membrane Vesicle, MV） －细菌分泌系统（Bacterial Secretion System）,是否还有直接，更为快捷、高效的交流方式？,－植物细胞通过胞间连丝（Plasmodesmata, PD） －哺乳动物细胞通过细胞间隙连接（Gap Junction）、 突触 (Synapse)、隧道纳米管（Tunneling Nanotube (TNT) －真核细胞的菌丝隔膜孔,Dubey和Ben-Yehuda采用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)作为模式菌，利用GFP荧光蛋白标记枯草芽孢杆菌，利用激光共聚焦显微镜直接证实了细菌纳管的存在以及细菌纳管能够传递细菌内部信息,有GFP,无GFP,,细菌纳管的发现,GFP: 绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein ),Dubey和Ben-Yehuda同时证实了革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌之间同样可以通过纳管进行信息交流,,,,,阴性菌,阳性菌,,,Dubey, 2011, Cell,细菌纳管的发现,纳管分为两类 管壁较厚，管腔较大，长度较长 (最长可超过1微米) 转运胞浆内的大分子物质 (蛋白质复合物、DNA),,894nm,,123nm,Dubey, 2011, Cell,细菌纳管的结构组成,管壁较薄，短而细 转运细胞间体积较小的小分子物质(营养素，蛋白质小肽，mRNA转录物) 纳管为膜性结构，类似细菌的膜囊泡，包括细胞壁、细胞膜及胞浆内容物,Dubey, 2011, Cell,,纳管分为两类,细菌纳管的结构组成,研究认为：纳管不仅是亲缘细菌间蛋白与DNA传递的重要方式，同时也是远缘细菌间的信息传递重要方式,Jeffrey, 2011, Cell,Bacillus subtilis携带GFP蛋白与抗原(CmR)，GFP蛋白通过纳管传递至Staphylococcus aureus, E. coli. 同时抗原通过纳管传递至未携带B. subtilis细菌中。
不同的子代遗传有B. subtilis传递的GFP蛋白和抗原,细菌纳管的功能,Balasubramaniama, 2013, Nano Communication Networks,纳管传递信息的速度大于细胞间其它交流方式，它的发现有助于突破传统纳米器件的瓶颈，能够应用于早期医疗诊断 例：将人体区域联网设备(BANs) 纳米化形成Nano-BANs设备置入体内，通过纳管的传导检测神经衰退病症或减缓神经肌肉病发,细菌纳管的意义,1998年，J. Bacteriology 报道了铁还原菌中的细胞色素，能跨越细胞外膜，直接将电子转移到外部金属上，形成电路 这是微生物燃料电池中电流的根本来源,细菌纳管的意义,From http://www.geobacter.org/,Derek Lovley,Massachusetts Amherst 马萨诸塞大学阿姆赫斯特分校,2002年，Science报道：Geobacter具有产电能力,2003年，Nature Biotechnology报道：Rhodoferax氧化葡萄糖时以80%的电子效率提供恒定的电流,2005年，Nature报道：Geobacter制造的“纳米导线” ，可能被细菌用来传递电子。
此发现为电子传递进一步开创了可能性,,,细菌纳管的意义,Lovley等人利用静电驱动显微镜（EFM）首次证明，电荷确实会沿着微生物的纳米导线蔓延，正如电子能在高导电性人工材料碳纳米管中流动一样 应用：将微生物放置于电导体中来探测环境污染物；研发基于导电微生物的微生物计算机,细菌纳管的意义,nanowires and outer-membrane cytochromes type Shewanella Geobacter Rhodoferax electron shuttling type Pseudomonas Geothrix,Nanowires,Cyt-C,Electron shuttling,细菌纳管的意义,Shewanella oneidensis MR-1 (Yuri A, 2006, PANS),,,Bacterium,Electrode,,,,,,,e-,e-,e-,Geobacter sulfurreducens (Lovley, 2005, Nature),细菌纳管的意义,每一个厘米级别长的“导线状细菌”包含一组从头至尾相互绝缘的细丝（细菌全身被相互绝缘的细丝包裹）,细菌纳管的意义,2012年Nature报道海底淤泥中携带“导线”的细菌,。