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1、1羟基喜树碱对人胰腺癌细胞 PANC-1 生长的抑制作用作者：赖日勇，李小波，许春鹃，叶金花【摘要】目的研究羟基喜树碱对人胰腺癌 PANC-1 细胞生长的抑制作用及其作用机制。方法 MTT 法测定羟基喜树碱对 PANC-1 细胞生长的抑制作用；流式细胞仪检测羟基喜树碱对 PANC-1 细胞周期、凋亡率和 Caspase-3 活性的影响。结果羟基喜树碱能抑制 PANC-1 细胞生长，并呈剂量依赖关系，其半数抑制浓度(IC50)为 51.52g/ml；流式细胞仪检测显示低浓度羟基喜树碱处理后可将细胞先后阻滞于 S 期和 G2/M 期，高浓度的羟基喜树碱则诱导细胞凋亡；细胞凋亡率和 Caspase-
2、3 活性随药物浓度升高和处理时间延长而逐渐递增。结论羟基喜树碱能抑制人胰腺癌 PANC-1 细胞的生长，其抗肿瘤作用机制与阻断细胞周期、诱导细胞凋亡和激活 Caspase-3 活性有关。【关键词】羟基喜树碱人胰腺癌细胞 PANC-1 抗肿瘤作用羟基喜树碱（Hydroxycamptothecin,HCPT）是从我国珙桐科植物喜树中分离出的 20 多个单体中抗癌作用最强的微量植物碱，是一种 DNA 拓扑异构酶I（DNAtopoisomeraseI,DNATopoI）抑制剂。大量的临床研究证明，羟基喜树碱具有抗肿瘤作用强和毒性低的优点，具有广谱抗肿瘤作用，对多种肿瘤细胞株及移植瘤有较高的抑制率1 。
3、目前羟基喜树碱对胰腺癌的治疗研究很少2 ，为此本文研究了羟基喜树碱对胰腺癌细胞 PANC-1 的抑制作用及其作用机制，以期为临床应用提供理论基础和依据。1 材料与仪器1.1 细胞系人胰腺癌细胞 PANC-1 由日本大阪大学消化器一般外科赠送。1.2 药品与仪器羟基喜树碱针剂（贵州汉方制药有限公司提供，批号20030403） ；噻唑蓝（MTT） 、DMEM 高糖培养基（GIBCO 公司产品） ；二甲基亚砜(DMSO，上海生物工程有限公司产品)；新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司产品） ；细胞周期测定试剂盒、Caspase-3 活性测定试剂盒、流式细胞仪（BectionDikinson 公
4、司产品） ；CO2 培养箱（Forma 公司产品） ；MultiskanMK3酶标仪(ThermoLabsystems 公司产品)。2 方法2.1 细胞培养将 PANC-1 细胞接种于含 10灭活新生牛血清的 DMEM 高糖培养液中（不含抗生素） ，在 37、5CO2、饱和湿度下培养。3d 传代 1 次，隔天换液 1 次，取对数生长期的细胞进行实验，分别用各种浓度的羟基喜树碱处理细胞，未加药组为对照组。2.2 细胞生长抑制率的测定采用噻唑蓝还原法进行检测。取对数生长期的2PANC-1 细胞接种于 96 孔培养板中(密度为 1104/孔)，每组设 6 个平行孔。加入用 DMEM 高糖培养液稀释的
5、不同浓度羟基喜树碱(6.25，12.5，25，50，100，200，400g/ml)分别培养，以未加羟基喜树碱为对照组。加药培养 48h 后每孔加入 MTT(5mg/ml)20l，37继续培养 4h 后，离心后吸去上清液，每孔加入 DMSO100l，振荡 10min 使结晶充分溶解,酶标仪570nm 波长检测各孔吸光度(A 值),计算细胞生长抑制率及半数抑制浓度（IC50）值。细胞生长抑制率（%）=(1-实验组平均 A 值/对照组平均 A 值)100%。2.3 细胞周期及凋亡率测定收集不同浓度羟基喜树碱(0，6.25，25，100g/ml)处理 24、48 和 72h 后的 PANC-1 细胞
6、，预冷的 PBS 洗涤细胞两次，预冷的 70%乙醇固定过夜。2000r/min 离心 10min，弃去乙醇，再次悬浮于预冷的 PBS，细胞经溴化丙啶(PI，10g/ml)染色 5min，4避光30min 后，上流式细胞仪，激发光波长为 488nm，吸收波长 610nm。检测细胞 DNA水平，根据 DNA 水平在流式细胞仪中得出每份样品的 G0/G1，S 和 G2/M 期细胞分布图。LY-SIS 软件(BectonDickinson 公司产品)分析。2.4 细胞 Caspase-3 活性（相对荧光值）测定收集不同浓度羟基喜树碱(0，6.25，25，100g/ml)处理 24，48 和 72h 后
7、的 PANC-1 细胞，预冷的 PBS 洗涤细胞 2 次，预冷的 70%乙醇固定过夜。2000r/min 离心 10min，弃去乙醇，再次悬浮于预冷的 PBS，按 Caspase-3 活性测定试剂盒说明书进行操作,上流式细胞仪测定 Caspase-3 活性（相对荧光值） 。2.5 统计学分析采用统计软件 SPSS14.0 进行数据处理。3 结果3.1 羟基喜树碱对 PANC-1 细胞生长抑制率的测定结果见图 1。羟基喜树碱能有效抑制 PANC-1 细胞生长，6.25，12.5，25，50，100，200 及 400g/ml 羟基喜树碱对 PANC-1 细胞的生长抑制率分别为(9.95.2)%、
8、(205.7)%、(35.86.9)%、(46.52.1)%、(65.63.4)%、(78.71.5)%、(891.6)%，其抑制作用呈浓度依赖性，半数抑制浓度（IC50）为 51.52g/ml，95%可信区间为(43.1961.49)g/ml。3.2 羟基喜树碱对 PANC-1 细胞周期及细胞凋亡的影响 PANC-1 细胞分别经6.25，25 和 100g/ml 羟基喜树碱作用后，细胞周期和凋亡率产生了明显的变化（见表 1） 。与对照组比较，低浓度的羟基喜树碱（6.25g/ml）处理后 G0/G1期比率明显下降，S 期和 G2/M 期比率明显上升，未出现明显细胞凋亡；25g/ml 组 S 期
9、比率上升，G2/M 期比率明显下降，处理 48h 出现明显细胞凋亡；100g/ml 组 G0/G1 期比率上升，G2/M 期比率下降，细胞凋亡为主；细胞凋亡率随着羟基喜树碱浓度升高和处理时间延长而明显上升。3.3 羟基喜树碱对 PANC-1 细胞 Caspase-3 活性的影响结果见图 2。与对照组比较，羟基喜树碱处理组 PANC-1 细胞 Caspase-3 活性明显上升(P0.05)，且随着羟基喜树碱浓度的升高和处理时间的延长而逐渐递增。表 1 羟基喜树碱对3PANC-1 细胞周期和凋亡率的影响（略）4 讨论胰腺癌是恶性程度最高的致死性肿瘤之一，多数胰腺癌患者明确诊断时已属中晚期，由于其侵
10、袭性强，诊断后中位生存期不到 6 个月，预后很差，但是目前胰腺癌临床化疗效果并不令人满意3 。本研究结果表明羟基喜树碱对胰腺癌细胞 PANC-1 有较强的生长抑制作用，应是治疗胰腺癌较好的化疗药。羟基喜树碱是细胞周期特异性药物，主要作用于 S 期，并对 G2/M 期边界有延缓作用；它能够抑制 DNA 拓扑异构酶将 DNA 断端重新接合的正常功能，并进一步造成 DNA 链的断裂损伤，从而抑制 DNA 的复制，阻断 RNA 的合成（即转录） 、干扰细胞分裂周期（延迟 G2 期） ，最终导致肿瘤细胞死亡4，5 。Goldwasser 等6的研究显示，低浓度羟基喜树碱作用人结肠癌细胞 SW620 后可
11、阻断细胞周期于 G2/M期，但高浓度的羟基喜树碱则阻滞于 S 期。与该研究相似，本研究显示胰腺癌细胞 PANC-1 在低浓度羟基喜树碱作用下，细胞周期被先后阻滞于 S 期和 G2/M 期，当羟基喜树碱为 25g/ml 时，则阻滞于 S 期，该结果说明低浓度羟基喜树碱造成 DNA 损伤及抑制 DNA 复制的强度有限，因此，部分细胞仍可进入 G2/M 期，同时由于羟基喜树碱具有干扰细胞分裂周期的功能，故可将这部分细胞阻断在G2/M 期，但当羟基喜树碱浓度进一步升高时对 DNA 的损伤作用增强，则细胞被完全阻断在 S 期。许多研究还显示羟基喜树碱可诱导肿瘤细胞凋亡7，8 ，本研究也显示在较高浓度时，
12、羟基喜树碱先将细胞周期阻滞于 S 期，然后诱导细胞凋亡，细胞凋亡率随着羟基喜树碱浓度升高和处理时间的延长而明显上升。细胞凋亡的分子机制研究表明，凋亡是多基因参与的级联反应过程。Caspase-3 是凋亡的执行器之一，多种刺激因子通过触发凋亡的信号转导途径，激活启动子 Caspase8、9、10，最终触发效应器 Caspase3、6、7911 。本研究中，细胞凋亡率随着羟基喜树碱浓度升高和处理时间的延长明显上升，而细胞Caspase-3 活性也随着羟基喜树碱浓度升高和处理时间的延长逐渐递增，因此证明羟基喜树碱依赖 Caspase-3 途径诱导 PANC-1 细胞凋亡。综上所述，羟基喜树碱对 PA
13、NC-1 细胞具有明显的生长抑制作用，其作用机制可能是通过抑制 DNA 拓扑异构酶，导致 DNA 的损伤，从而干扰细胞周期（阻滞于 S 期及 G2/M 期）以及依赖 Caspase-3 途径诱导细胞凋亡，最终导致 PANC-1细胞死亡。【参考文献】1ZhangR,LiY,CaiQ,etal.Preclinicalpharmacologyofthenaturalproductanticanceragent10-hydroxycamptothecin,aninhibitoroftopoisomeraseIJ.CancerChemotherPharmacol,1998，41(4):257.2顾群浩,
14、廖泉,张胜华,等.羟基喜树碱对人胰腺癌细胞作用的研究J.现代中西医结合杂志,2004,13(5):570.43BornmanPC,BeckinghamIJ.ABCofdiseasesofliver,pancreas,andbiliarysystem.PancreatictumoursJ.BMJ,2001,322(7288):721.4McDonaldAC,BrownR.Inductionofp53-dependentandp53-independentcellularresponsesbytopoisomerase1inhibitorsJ.BrJCancer,1998,78(6):745.5C
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16、步研究J.中华消化杂志,2001,21(5):274.8柴丽萍,苏振忠,冼志雄.羟基喜树碱对喉鳞癌细胞株抑制作用的研究J.癌症,2003,22(4):372.9YangY,LiCC,WeissmanAM.Regulatingthep53systemthroughubiquitinationJ.Oncogene,2004,23(11):2096.10KimKW,KimBJ,ChungCW,etal.Caspasecleavageproductlackingamino-terminusofIkappaBalphasensitizesresistantcellstoTNF-alphaandTRAIL-inducedapoptosisJ.JCellBiochem,2002,85(2):334.11FuYR,YiZJ,YanYR,etal.Hydroxycamptothecin-induc
