《细胞工程基本技术幻灯片》由会员分享，可在线阅读，更多相关《细胞工程基本技术幻灯片（116页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第三章、细胞工程基本技术,基本技术,实验室条件 无菌技术 显微技术细胞观察与分析细胞分离细胞保存与复苏,实验室基本组成,细胞工程实验室它必须满足三个基本的需要，即： 实验准备，包括培养基配制，洗涤与灭菌等； 无菌操作； 控制培养。,基本实验室,准备室： 准备室的功能就是进行一切与实验有关的准备工作。要求宽敞明亮，通风条件好。接种室： 接种室的功能是进行无菌操作。要求封闭性好，干燥清洁，能较长时间保持无菌。房间一般不宜过大，其规模根据实验需要而定。接种室除了出入口和通气口外，应行密闭。培养室： 培养室的功能是对离体材料进行控制培养。其首要要求是要能控制光照和温度，其次为防止微生物感染，培养室应保
2、持干燥和清洁。,辅助实验室,细胞学实验室 ：其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。摄影室及暗室： 其功能是进行培养材料的摄影记录和胶片冲印。在有条件的情况下可建立此实验室。生化分析室： 在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。,实验室布局的基本要求,便于隔离、便于操作、便于灭菌、便于观察。,实验用品及主要设备,玻璃器皿常用器械细胞培养的主要设备,玻璃器皿,液体储存瓶吸管离心管培养皿培养瓶与培养板其它器皿1,常用器械,解剖刀、镊子、剪刀、洗耳球、封口膜、酒精灯等,胞培养的
3、主要设备,基本设备： 冰箱、天平、酸度计、纯水器、电炉、培养基分装器、搅拌器。灭菌设备 ：蒸汽压力灭菌锅、烘箱、过滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯。无菌操作设备 ：净化工作台、接种箱。光温控制设备 ：时间程序控制器、空调及温度感应器。细胞培养设备： 培养设备根据需要而定，包括培养架、培养箱、摇床、生物反应器等。细胞学鉴定设备 ：光学研究显微镜、倒置显微镜等。 除上述基本设备外，如果有条件和需要还可配制摄影设备、生化分析设备等。,无菌技术,无菌技术是一个技术体系，涉及多方面因素、多个环节，只有诸因素和环节都处理好，才能达到无菌。 培养基 器皿材料 接种工具 操作环境 培养室 工作台面 具体的灭菌方
4、法有多种 污染检测与控制,玻璃器皿清洗,浸泡刷洗浸酸冲洗,无菌室,无菌操作室和无菌培养室要求：墙壁光滑、地面平坦无缝，门窗密闭，无空气对流,灭菌种类,物理灭菌：高温高压灭菌、干热灭菌、射线辐照灭菌、过滤灭菌化学灭菌：熏蒸灭菌、消毒液灭菌（酒精、升汞、漂白粉、新洁尔灭、次氯酸钠、次氯酸钙、过氧化氢）抗生素消毒：在动物细胞培养中，常采用青霉素、链霉素、卡那霉素、制霉菌素等抗生素抑制细菌、真菌等污染。根据灭菌对象选择不同的灭菌方法,高温高压灭菌,原理：在121高温和0.8kg/cm2-1.1kg/cm2的压力下，一般持续15-20分钟后，就可杀死一切微生物的营养体及其孢子。适用于器皿、工具、衣物和培
5、养基灭菌。,干热灭菌法,将物品放入烘箱，利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固而达到灭菌的目的。适用于玻璃器皿。,射线灭菌,紫外光常用于培养室和接种箱或超净台的灭菌。操作前开灯20分钟可达到灭菌效果。,过滤灭菌,原理：将带菌的液体或气体通过孔径小于0.45uM微孔装置，使杂菌留在滤板上而液体或气体进入无菌空瓶中，从而达到除菌目的。常用于不能以高温高压灭菌的培养液、有机物质溶液和酶液的除菌。组织培养中常用的过滤除菌器是滤膜过滤器，它清洗方便，过滤效果好。,蒸灭菌,用能杀死微生物的蒸汽进行灭菌，适用于无菌室的定期灭菌。常用的方法是将甲醛和高锰酸钾混合后，产生大量蒸气，以杀死微生物，效果较好。,消毒液灭
6、菌,依化学灭菌剂的不同而适用于不同场合的灭菌。70%酒精几乎适用于组织培养中如各种器皿、培养材料、无菌室、接种箱、工作台、操作人员的手等；升汞、漂白粉、新洁尔灭、次氯酸钠、次氯酸钙、过氧化氢、抗菌素等适用于培养材料的灭菌。,室内灭菌,2%的新洁尔灭擦洗， 70%乙醇喷雾， 紫外灯照射约20分钟定期用甲醛和高锰酸钾熏蒸,试剂和器皿的灭菌,包括培养基、特殊药品和所有无菌操作使用的器皿的灭菌培养基通常使用灭菌锅通过高压蒸汽灭菌进行灭菌,污染检测与控制,细菌：可采用抗生素预防真菌：可采用抗真菌剂防治支原体：可采用抗生素、加温处理（41）、使用支原体特异性血清病毒：脱毒细胞交叉污染：严格操作规程,显微技
7、术,显微观察技术：显微操作技术：借助显微操作仪采用细微玻璃针或用微吸管、微电极、微热电偶等可进行细胞解剖、物质的抽取及注入、移植等操作。,细胞观察与分析,细胞计数与活力分析细胞固定与染色观察凋亡细胞观察染色体分析,细胞计数与活力分析,采用血细胞计数法计数活力分析： 台盼蓝染色法：死细胞着色 MTT ：活细胞使其还原为兰色，用酶标仪测定490nm 处的光密度，计算细胞相对活力,血球计数板,计数法,细胞固定与染色观察,细胞固定甲醇-醋酸FAACarnoy细胞染色苏木精-伊红（H.E)染色法Giemsa染色法Feulgen染色法考马斯蓝染色法免疫荧光法免疫过氧化物酶染色法,凋亡细胞观察,形态观察:生
8、化分析:锚定蛋白:检测凋亡早期PI:检测晚期或死细胞分子技术:梯形电泳图谱,PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,FITC-AnnexinV染色,FITC-AnnexinV和PI染色,梯形电泳图谱,染色体分析,样品处理:秋水仙素低渗处理固定化染色观察,细胞分离,细胞初步分离差速离心分离法 单个细胞的获得 软琼脂培养法 和 有限稀释法 显微操作分离法 流式细胞仪分离 激光捕获显微切割 免疫磁珠分离,细胞保存与复苏,目前广泛应用的细胞保存方法是低温冷冻保存法预保留细胞经消化分散后，加入冷冻保护液，同时将细胞悬液稀释按1ml/安瓿分装细胞悬液，在火焰下将安瓿封口。将封口的安瓿放入慢冻机内，按1/m
9、in的速度缓慢冷冻，使温度降至-25冻结好的安瓿放入CO2低温冰柜或液氮罐中，温度达-150- -190 如果需要复苏，可将安瓿取出后立即放入37 水浴中，使其快速融化,思考题,植物组织培养的基本实验室有哪些？实验室布局的基本要求是什么？ 消毒灭菌种类有哪几类？ 使用高压锅的基本步骤是什么？用血球计数板进行计数时，细胞数/L=N*25/5*10*106*稀释倍数，N指什么？对细胞进行染色体分析中，样品处理时加秋水仙素起什么作用？简述细胞低温冷冻保存的方法,第三章、细胞工程基本技术,基本技术,实验室条件 无菌技术 显微技术细胞观察与分析细胞分离细胞保存与复苏,实验室条件,实验室基本组成实验用品及
10、主要设备,实验室基本组成,细胞工程实验室它必须满足三个基本的需要，即： 实验准备，包括培养基配制，洗涤与灭菌等； 无菌操作； 控制培养。,基本实验室,准备室： 准备室的功能就是进行一切与实验有关的准备工作。要求宽敞明亮，通风条件好。接种室： 接种室的功能是进行无菌操作。要求封闭性好，干燥清洁，能较长时间保持无菌。房间一般不宜过大，其规模根据实验需要而定。接种室除了出入口和通气口外，应行密闭。培养室： 培养室的功能是对离体材料进行控制培养。其首要要求是要能控制光照和温度，其次为防止微生物感染，培养室应保持干燥和清洁。,辅助实验室,细胞学实验室 ：其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。要求清洁、
11、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。摄影室及暗室： 其功能是进行培养材料的摄影记录和胶片冲印。在有条件的情况下可建立此实验室。生化分析室： 在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。,实验室布局的基本要求,便于隔离、便于操作、便于灭菌、便于观察。,实验用品及主要设备,玻璃器皿常用器械细胞培养的主要设备,玻璃器皿,液体储存瓶吸管离心管培养皿培养瓶与培养板其它,培养器皿1,培养器皿2,常用器械,解剖刀、镊子、剪刀、洗耳球、封口膜、酒精灯等,常用器械,细胞培养的主要设备,基本设备： 冰箱、天平、酸度计、纯水器、电炉、培养基分
12、装器、搅拌器。灭菌设备 ：蒸汽压力灭菌锅、烘箱、过滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯。无菌操作设备 ：净化工作台、接种箱。光温控制设备 ：时间程序控制器、空调及温度感应器。细胞培养设备： 培养设备根据需要而定，包括培养架、培养箱、摇床、生物反应器等。细胞学鉴定设备 ：光学研究显微镜、倒置显微镜等。 除上述基本设备外，如果有条件和需要还可配制摄影设备、生化分析设备等。,电子天平,酸度计,不锈钢蒸馏水器,双重蒸馏水器,磁力搅拌器,灭菌锅,灭菌锅,烘箱,过滤灭菌装置,紫外灯,超净工作台,培养架,光照培养箱,摇床,生物反应器1,生物反应器2,植物细胞培养反应器,显微镜,无菌技术,无菌技术是一个技术体系，涉
13、及多方面因素、多个环节，只有诸因素和环节都处理好，才能达到无菌。 培养基 器皿材料 接种工具 操作环境 培养室 工作台面 具体的灭菌方法有多种 污染检测与控制,玻璃器皿清洗,浸泡刷洗浸酸冲洗,常用器械,无菌室,无菌操作室和无菌培养室要求：墙壁光滑、地面平坦无缝，门窗密闭，无空气对流,培养室1,培养室2,工作台面,灭菌种类,物理灭菌：高温高压灭菌、干热灭菌、射线辐照灭菌、过滤灭菌化学灭菌：熏蒸灭菌、消毒液灭菌（酒精、升汞、漂白粉、新洁尔灭、次氯酸钠、次氯酸钙、过氧化氢）抗生素消毒：在动物细胞培养中，常采用青霉素、链霉素、卡那霉素、制霉菌素等抗生素抑制细菌、真菌等污染。根据灭菌对象选择不同的灭菌方
14、法,高温高压灭菌,原理：在121高温和0.8kg/cm2-1.1kg/cm2的压力下，一般持续15-20分钟后，就可杀死一切微生物的营养体及其孢子。适用于器皿、工具、衣物和培养基灭菌。,干热灭菌法,将物品放入烘箱，利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固而达到灭菌的目的。适用于玻璃器皿。,烘箱,射线灭菌,紫外光常用于培养室和接种箱或超净台的灭菌。操作前开灯20分钟可达到灭菌效果。,过滤灭菌,原理：将带菌的液体或气体通过孔径小于0.45uM微孔装置，使杂菌留在滤板上而液体或气体进入无菌空瓶中，从而达到除菌目的。常用于不能以高温高压灭菌的培养液、有机物质溶液和酶液的除菌。组织培养中常用的过滤除菌器是滤膜
15、过滤器，它清洗方便，过滤效果好。,过滤除菌装置,熏蒸灭菌,用能杀死微生物的蒸汽进行灭菌，适用于无菌室的定期灭菌。常用的方法是将甲醛和高锰酸钾混合后，产生大量蒸气，以杀死微生物，效果较好。,消毒液灭菌,依化学灭菌剂的不同而适用于不同场合的灭菌。70%酒精几乎适用于组织培养中如各种器皿、培养材料、无菌室、接种箱、工作台、操作人员的手等；升汞、漂白粉、新洁尔灭、次氯酸钠、次氯酸钙、过氧化氢、抗菌素等适用于培养材料的灭菌。,室内灭菌,2%的新洁尔灭擦洗， 70%乙醇喷雾， 紫外灯照射约20分钟定期用甲醛和高锰酸钾熏蒸,试剂和器皿的灭菌,包括培养基、特殊药品和所有无菌操作使用的器皿的灭菌培养基通常使用灭菌锅通过高压蒸汽灭菌进行灭菌,
