第四章--B真核调控

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1、第一节 DNA水平的调控 一. DNA的甲基化与去甲基化 怎样判断哪些位点甲基化,哪些位点没有甲基化,采用同裂酶来处理待测序列,比较相应切点,就能弄清楚.,571-572,Hpa,二.亲本印记(imprinting),印记:来源于父母本的一对等位基因表达不同。如源于父本的IGF- (胰岛素样生长因子)基因可表达，而源于母本的则不能表达。此是由于卵母细胞中的IGF- 已被甲基化，而精子中的IGF-未被甲基化，所以这一对等位基因在合子中表现不同。 目前在人类和鼠身上已辨明了20种印迹基因。大多数人类的印迹基因集中在三个簇中。在每个基因簇上都存在着特异的印记盒 (imprinting box)，能顺

2、式调节印迹基因的亲本特异性表达，这些位点表现出亲本特异性的甲基化作用和去甲基化作用。,注解(2.4.1DNA后成遗传与印记基因 DNA后成遗传学由胚胎学家Waddington1953年提出。 后成遗传：（ epigenetic inheritance）是指基于非基因序列改变所致基因表达水平变化，如DNA甲基化和染色质构象变化等 。 印记基因（imprint gene)：由于一些可遗传的修饰作用（如甲基化）使配子（精子或卵子）中某个单一的等位基因的活性（monoallelic activity）在胚胎发育中具有标记性特点。 DNA甲基化是后成遗传的，独立于DNA密码遗传之外。),在小鼠早期胚胎中

3、，父系等位基因为非甲基化而表 达，母系等位基因因甲基化而沉默。 在子代小鼠形成配子时发生了什么？,亲本的IGF-等位 基因在早期胚中被差异甲基化，在成体形成配子时仍保留原甲基化的模式。,第二节转录水平的调控 一顺式作用元件和反式作用因子： 顺式作用元件P573 (1) 核心启动子成分 ， 如 TATA 框 ； (2) 上游启动子成分，如 CAAT框 ,GC框 ; (3) 远上游顺序 ：如增强子 ，减弱子 、 静 息 子 ,酵 母 的 UAS （ upstream activator sequences）等。 (4) 特殊细胞中的启动子成分 ：如淋巴 细胞中的 Oct (octamer）和B。,

4、反式作用因子可以分为3类； (1) 通用反式作用因子，主要识别启动子的核 心启动成分TATA框，如TBP； （2）特殊组织与细胞中的反式作用因子，如淋巴细 胞中的Oct-2； （3）和反应性元件（response elenents）相结合的反 式作用因子。 如HSE（热休克反应元件，heat shock response element）， GRE（糖皮质激素反应元件glucocorticoid response element）； MRE（金属反应元件，metal response element）； TRE（肿瘤诱导剂反应元件，tumorgenic agent response eleme

5、nt);,真核生物的转录起始需要RNA聚合酶以及 许多蛋白质因子的参与。凡是转录起始过 程必需的蛋白质，只要不是RNA聚合酶的 组成成分，就可以将其定义为转录因子 (transcription factor，TF)。,RNA聚合酶的转录因子用TFX表示， RNA聚合酶的转录因子用TFX表示， RNA聚合酶的转录因子用TFX表示，X 为不同的字母，代表各个不同的因子。,RNA聚合酶的启动子 RNA聚合酶的启动子具有以下四个元件。 1转录起始点 在真核生物中，转录起始点的序列并没有多大的同源性，但mRNA的第一个碱基往往是腺嘌呤，其两侧为嘧啶，这个同源区称为起始子(initiator，Inr)，也

6、称为帽子位点(cap site)。,2TATA框(TATA box) 许多启动子含有一个称为TATA框的序列，通常位于转录起始点上游30bp处。相对于转录起始点而言，TATA框是具有相对固定位置的上游元件。TATA序列常位于富含GC的序列内，这可能是它发挥功能的条件之一。TATA框具有定位转录起始位点的功能。在这一点上，TATA框和原核生物的启动子有些相似。,3CAAT框（CAAT box） CAAT框位于转录起始点上游约-80bp处，一致序列为GGC(T)CAATCT，因其保守序列为CAAT而得名。CAAT框距离转录起始位点的大小对其作用影响不大，并且正反方向排列均能起作用。CAAT框在决定

7、启动子转录效率上有着很强的作用，它的存在可增加启动子的强度。,4GC框(GC box) GC框位于-90bp附近，核心序列为GGGCGG，一个启动子中可以有多个拷贝，并且可以正反两个方向排列。,5RNA聚合酶在启动子上的转录起始 RNA聚合酶必须和通用转录因子相互作用，共同组成基本转录装置才能起始转录。通用转录因子(general transcription factor，GTF)指RNA聚合酶在任何启动子上起始转录所必需的一组蛋白质。这些通用转录因子称为TFX。在真核生物中，RNA聚合酶的各个亚基和通用转录因子都是保守的。,TFD通用转录因子识别TATA元件，它是一个多亚基复合体。TFD中与

8、TATA序列结合的成分称为TBP(TATA binding protein)。此复合体中的其他亚基称为TAF，即TBP关联因子(TBP-associated factor)。某些TAF帮助在特定的启动子处结合DNA，其他的则控制TBP结合DNA的活性。,TBP一旦结合到DNA上，就使TATA序列极大地扭曲变形。形成的TBP-DNA复合体提供了一个平台，把其他通用转录因子和聚合酶本身募集到启动子上。在体外，这些蛋白质按照下列顺序在启动子处组装（图3-12）。,TFA、TFB和TFF依次与聚合酶结合在一起，然后是TFE和TFH依次结合在RNA聚合酶上游。包含这些成分的前起始复合体形成后，启动子就开

9、始解旋。,RNA聚合酶的大亚基有一个C端域(CTD)，延伸成一个“尾巴”。RNA聚合酶最初的“尾巴”在很大程度上未被磷酸化，但是在延伸复合体里发现在其尾巴上出现了多个磷酰基基团，可以帮助RNA聚合酶摆脱起始转录所用的大部分通用转录因子。,(一) 蛋白质直接和DNA结合 1. 螺旋转角螺旋（Helix-turn-helix, HTH）： 如LacO的R 蛋白，的CI，Cro蛋白，涉及酵母交配型的a1和a2蛋白。真核生物中的Oct-1和Oct-2； 2.锌指结构（zinc finger） 单个的锌指保守序列是：Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5- Leu-X2-His-X2-His 型:

10、 2Cys/2His : TF IIIA, SP1 型: 2cys/2cys : GAL4,3. 亮氨酸拉链（Leucine ziipper） 4. 螺旋一环一螺旋（HLH） 在HLH中带有碱性区的肽链称为 碱性HLH（bHLH，protein）。 bHLH又分为两类。 A类是可以广泛表达的蛋白，包括哺乳动物的E12/E47（可和免疫球蛋基因增强子中的元件结合）和果蝇da（daughterless,性别控制的总开关基因）的产物； B类是组织特异性表达的蛋白，包括哺乳动物的MyoD(肌浆蛋白（myogen）基因的转录因子 果蝇的AC-S（achaete-scute 无刚毛基因的产物）,5同源异形

11、结构域（Homeodomains，HD） 是一种编码60aa的序列，长180bp，它存在于很多控制果蝇早期发育基因中，在高等生物中也发现了相关基序。 HD的C-端区域和原核阻遏蛋白的HTH同源，但也有几点不同: （1）HD的C端由3个-螺旋构成，螺旋3结合于大沟，长17aa；而阻遏蛋白由5个-螺旋构成，螺旋3长仅9个 aa； （2）原核的HTH的以二聚体形式与DNA(大沟) 结合，靶序列是回文结构，而HD是以单体形式与DNA结合，靶序列不是回文结构； （3）HD N-端的臂位于小沟，而HTH螺旋1的末端(N-端)与DNA的背面接触。,（二）蛋白质和配基的结合 甾类受体蛋白一般都具有3个不同的功

12、能区： （1）N-端区是激活转录所需的区域，不 同受体之间此区的同一性仅小于15%； （2）DNA结合及转录活化区，同一性较高为42-94%； （3）C-端的激素结合和二聚体形成区， 同一性为15-57%。,甾的基本结构和命名 甾族化合物是广泛存在于动植物中的重要天然产物。在这类化合物的分子式中，都含有一个环戊烷并多氢菲的基本骨架，并且带有三个侧链，其通式可表示为： 其中R1和R2 一般为甲醛，通常把这种甲醛称为角甲醛。R3为具有2，4，5，8，9，10个碳原子的侧链。甾是个象形字。是根据这个结构而来，“田”表示四个环“”则表示为三个侧链。,甾族的种类 根据甾族化合物的存在和化学结构可以分为：

13、 甾醇、胆汁酸、甾族激素、甾族生物碱等 甾族激素包括性激素和肾上腺皮质激素,糖皮质激素类包括可的松（皮质素）和氢化可的松（皮质醇）等。这类激素对糖、蛋白质和脂肪代谢都有影响，主要作用是促进蛋白质分解和肝糖原异生。当食物中糖类供应不足（如饥饿）时，糖皮质激素分泌增加，将促进肌肉和结缔组织等组织蛋白质的分解，并抑制肌肉等对对氨基酸的摄取和加强肝糖异生，还促进肝糖元分解为葡萄糖释放入血以增加血糖的来源，血糖水平得以保持，使脑和心脏组织活动所需的能源不致缺乏。,作为药物使用，大剂量的糖皮质激素有抗 炎、抗过敏、抗毒素作用，有抗休克和抑 制免疫反应等作用，故医学上应用广泛， 但也有不可忽视的副作用。,(

14、三) 蛋白质之间的相互作用 酵母半乳糖代谢中GAL80和GAL4的相互作用： 酵母半乳糖代谢调控： （1）被调节的基因多位于不同的染色体上； （2）负调节蛋白GAL80不直接和DNA结合，而是和 GAL4结合，占据其功能域来阻遏转录的； （3）作为正调节因子不仅需要半乳糖作为诱导物，还需要GAL4蛋白作为转录因子，分别和各个被调节基因上游元件UAS结合，促进转录。,第三节 转录起始和加工的调节,一. 转录起始的选择 酵母蔗糖酶基因，有6个基因（Suc15,7）位于不同的染色体上。每一个基因都可以转录合成蔗糖酶，但有胞内酶和胞外酶两种不同形式。 前者的合成不受葡萄糖存在的影响，但含量低； 后者的

15、合成受到葡萄糖的抑制。,两种酶的结构相似， 胞外酶仅多了信号序列，经切除后胞外酶比胞内酶在N-端仅多了一个Ser 经分析发现Suc-2 基因有3个TATA框，但尚不清楚和2种酶的关系.,二选择性加工 (一) 不同5端的选择 (二) 选择不同的3端 (三) 选择不同外显子,第四节 翻译的调控,一.mRNA运输控制（transport control）是对转录本从细胞核运送到细胞质中的数量进行调节; 二mRNA翻译的控制 三mRNA的结构和翻译的效率 四翻译的起始调节 五选择性翻译 六反义RNA调控 七翻译的自我调节,一mRNA运输控制 在细胞核内转录,在细胞质中翻译.在真核细胞核中剪接体滞留模型

16、. 二mRNA翻译调控 降解控制,短寿命的mRNA的3端非翻译序列中有一组富含AU的序列,与mRNA不稳定有关. 三mRNA的结构和翻译的效率 5端帽子结构阻碍翻译,3端poly(A)影响到mRNA的稳定性和翻译效率. poly(A)结合蛋白PABP,10nt.,poly(A)的存在有重要的功能：它是mRNA由细胞核进入细胞质所必需的形式，它大大提高了mRNA在细胞质中的稳定性。 mRNA的poly(A)序列与poly(A)结合蛋白poly(A) binding protein，PABP相结合。PABP单体分子质量约为70kD，与poly(A)尾的1020个碱基相结合，防止mRNA降解的保护作用需要PABP的结合。,四翻译的起始调节,和珠蛋白的合成 在二倍体细胞中都有4个-珠蛋白基因，2 个 -珠蛋白基因，它们之间的浓度比应是 ：=2：1，而实际上是1：1。 在无细胞系统中加入等量的mRNA和 mRNA和