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1、1应用寡核苷酸芯片进行 HLA-DQA1 位点基因分型作者：王彤，王天骄，何群，张玉魁，马佳明，侯伟建，王绍成，潘忠诚，赵雨杰【摘要】为了构建 HLA-DQA1 位点寡核苷酸分型芯片并籍此建立一种应用于HLA 系统基因分型的集成化技术平台，在多态性集中的 HLA-DQA1 第二外显子区域，自行设计一套寡核苷酸分型探针；采用本实验室自建的方法，制成寡核苷酸芯片。提取的基因组 DNA 以组间特异性引物，单侧引物荧光标记，行不对称扩增。杂交后扫描检测分析杂交信号，确定 HLA 等位基因型；分型结果以标准 DNA 和PCR 产物测序检测。结果表明：100 例样本芯片分型全部成功，其中 50 例标准DN
2、A 与其模板相符，另 50 例临床样本中随机选取的 10 例与其测序结果相符，其中 2 例分型结果不完全；重复杂交实验中，位点重现率 95%。结论：研制的 HLA-DQA1 等位基因分型芯片，其准确性和重现性理想，且操作简便、快捷，有广泛的应用前景。【关键词】基因分型HLA-DQA1GenotypingbyUsingOligonucleotideMicroarraysAbstractInordertofabricatetheHLA-DQA1genotypingchipanddevelopanintegrated，paralleltechnicalplatformtotypeHLAsystem，
3、apairofprimersandasetofprobesweredesignedaccordingtothesequencesofHLA-DQA1exon2，wherethepolymorphismisconcentrated.Theoligonucleotidechipwasmadewiththemethodsdevelopedinourlaboratory.ThetargetDNAwasasymmetricallyamplifiedwiththelabeledsenseprimer.Thesignalswerescannedandanalyzedafterthehybridization
4、betweenmicroarrayandPCRproduct.Thealleletypesofthesampleswereidenlified.TheresultwasverifiedbythestandardDNAandDNAsequencing.Theresultsshowedthatthegenotypingwassuccessfullycarriedoutin50standardDNAsamplesand50clinicalsamples.Amongthem，resultsofthe50standardDNAsamplesmatchedtheirtemplates.Intheother
5、50samples，resultsoftherandomlyselected10matchedtheirsequencingresultsexceptthattwoofthemgottheincompletelyresult.Inreproducibletests，thesignalreappearratewas95%.ItisconcludedthatHLA-DQA1genotypingbyusingourarraysystemissimpleandconvenientwithsatisfiedaccuracyandreproducibility.KeywordsHLA-DQA1；genot
6、ype；oligonucleotidechip组织配型的情况是影响器官移植成活率的关键因素，同时，特定的 HLA 基因2座位还和某些疾病相关联，因此 HLA 的分型工作亦受到广泛重视。到目前为止，国内外的 HLA 的分型研究仍多集中于 A、B、DR 位点。近年来，组成较为复杂的型位点因与疾病有较多关联而多有报道。其中 DQ 位点与扩张性心肌症1 ，病毒性乙型肝炎2 ，糖尿病3，4 ，银屑病5等多种疾病的罹患率及预后相关。1996 年，HLA-DQ 也被定义为移植抗原6 。目前，HLA 分型有血清学分型和基因分型，后者更具优势和发展前途。对基因分型国际上推荐使用 PCR-SSP 和 PCR-SS
7、OP 方法，但两者在设计或操作上略显繁琐。基因芯片的问世为 HLA 分型工作提供了新的思路，基因芯片的高通量、集成化和并行检测等优势使其极为适用于复杂的 HLA 遗传系统。国内外在这方面的报道很多，但尚没有成熟的分型产品问世，也未见临床大规模应用的报道。本研究使用自行构建的寡核苷酸芯片（oligonucleotidemicroarrays） ，对 HLA-DQA1位点进行基因分型检测，旨在建立一套成熟的分型技术，用于复杂的 HLA 系统的分型研究。材料和方法DNA 样本50 例临床样本采自中国医科大学附属第一医院，50 例标准 DNA 样品由中国刑警学院法医系法医学教研室提供7 。主要试剂及仪
8、器手臂分子氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)(Sigma 公司)，PCR 试剂盒及相关试剂(Promega 公司)，鲑鱼精 DNA（Sigma 公司） ，其他化学试剂均为分析纯。PCR扩增仪（BiometraPersonalPCRsystem，USA） ，生物芯片点样仪(MG600，BioRobotics，England)，激光共聚焦扫描仪(GeneTACTMLSIV，GenomicSolutionsInc.USA)引物及探针根据 GenBank 数据库新近公布的 HLA-DQA1 等位基因序列，在多态性集中的exon2 保守区及变异区分别设计 1 对引物及 16 条特异性分型探针，交由上海生
9、物工程公司合成，并在正义链引物 5端作 FITC 标记，序列如下：P1(+)Exon2:5-TGTATTACATGGGAATATGTGATTTTAGA-3；P2(-)Exon2:5-CAGGGGTTGGAAATGTCCAC-3，并在各探针 5端做氨基修饰。各组探针的序列见附表。全血基因组 DNA 的提取改良的酚/氯仿法:1ml 抗凝的外周血，896g 离心 5 分钟，分离中层白细胞后，传统酚/氯仿/异丙醇法8抽提 DNA，-20保存。3PCR 扩增与产物标记扩增体系 20l，含基因组 DNA1l。以组间特异性引物，行 120 不对称扩增。扩增条件 965 分钟，9630 秒，5940 秒，72
10、40 秒，35 个循环。产物以聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测。载片制备本室自建流程。市售玻片（20mm20mm）于铬酸溶液中浸泡 12 小时以上，蒸馏水洗净，1NNaOH 浸泡 1 小时，丙酮化 3 分钟。浸入手臂分子溶液（2%氨基丙基三乙氧基硅烷，以 95%丙酮溶解）10 分钟，丙酮清洗，104烤干后，5%戊二醛中浸泡过夜。寡核苷酸微阵列的制备以预先摸索好的条件，将 16 条寡核苷酸探针以探针缓冲液重悬至80mol/L，与同等浓度的阳性对照探针（全序列匹配的反义链引物） 、阴性对照无关探针（与目标序列同源性低于 50%） 、空白对照探针缓冲液，共同加入 384孔板。启动生物芯片点样仪，制
11、成预先设计好的微阵列。点样中注意保湿，点样后 37水化过夜，80烤干，备用。Table.Probesequences(略)封闭与核酸杂交按本室方法9 。取制备好的寡核苷酸芯片，用前以 0.1%SDS 洗去多余的未共价结合的探针。浸入 5二乙胺（0.01MPB，pH=9） ，室温封闭 30 分钟，充分洗净吹干。PCR 产物加杂交液（鲑鱼精 DNA10g/ml）按 11 稀释混匀，取8l 覆盖于各微阵列，加放硅烷化盖片。置入湿度适宜的杂交舱中 55保温 30秒。洗涤与检测分析取出杂交芯片，冲去盖片。用预热至 60的洗液(1SSC/0.1%SDS，0.5SSC/0.1%SDS，0.1SSC)行梯度洗
12、涤，用 ddH2O 洗净，吹干。使用激光共聚焦扫描仪检测，CCD 成像软件分析杂交信号，确定样本的基因型。结果基因组 DNA 的获取及靶基因的扩增基因组 DNA 的浓度为 100-200ng/l。A260/280 值 167-2.05，纯度均50。PCR 产物经 PAGE 检测，可见扩增条带清晰，特异性理想，对称产物长度 538bp，与设计相符。4寡核苷酸芯片的分型100 份样品分型全部成功。其中 50 份标准样品分型结果与其模板全部相符。另 50 份临床血样随机抽取 10 份进行 PCR 产物测序，2 份分型结果不完全相符(测序确定其为复合型，分别为 0301/04，04/06；基因芯片分型
13、为单纯型，即0301，04)，另 8 例正确。图 A，B，C 示 1 例选择测序的临床样本。分型结果的稳定性为验证芯片的稳定性及重现率，随机选取 10 份样品重复 5 次杂交实验。16个分型位点中，2 份样品完全重复，3 份可重复 15 个分型位点，5 份重复 14 个分型位点。重现率 95%。讨论HLA 复合体遗传区位于 6P21.31，长约 3600kb，约占人类基因组总长度的1/3000。第十三届国际组织相容性专题会议确定已发现的 HLA 等位基因达到1340 个。HLA 血清学分型多用微量淋巴细胞毒实验，在 20 世纪 80 年代中期之前是 HLA 研究的重点，其检查类抗原经济有效，但
14、在检测类抗原时却遇到了困难：一方面类抗原在未激活 T 细胞上不表达，需分离纯化 B 细胞；另一方面类抗原多由双座位等位基因构成复杂的多态性，使得准确判定相应等位基因产物的抗原特异性十分困难。Opelz 等10曾将来自 58 个移植中心的 4000 份冰冻组织标本进行回顾性分析，发现血清学方法分型 HLA-A、HLA-B 错误率 4%-9.2%，而 HLA-DR 分型错误率高达 25%。因此类抗原多不采用血清学分型。目前，HLA 基因分型国际上推荐使用 PCR-SSP 和 PCR-SSOP。Bunce 等11用 188个引物，经 144 次 PCR 建立一步法 PCR-SSP，成功地对 HLA-
15、、类所有抗原进行了分型。该方法特异性较高，但主要依赖于 PCR 技术，操作略显繁琐，且结果分析非常复杂。PCR-SSOP 因具有灵敏度高、误差率小、样本量少的优点，是现今国内外分型应用最多的方法。但该法选择的支持介质是膜12或微滴定板13 ，对于 HLA 复杂的等位基因，不具有集成化的优势。基因芯片作为“20 世纪影响最为深远的科学技术手段之一” ，非常适合分型复杂的 HLA 系统，已引起众多科研机构的关注。但各家在制作分型芯片时方法差别相当大，表明基因芯片的技术流程还需要标准化。国际上对实质性器官移植通用“六抗原无错配”标准，即 HLA-A、-B、-DR在供受者中无错配，记为“0AgMM”
16、14 。而 HLA-DQA1，-DQB1 及-DRB1 的连锁不平衡导致在限定人群中产生预期的抗原系。如大多白种人供受 HLA-A、-B、-DRB1 匹配者，HLA-DQB1 及 HLA-DQA1 也同样匹配15 。本研究所采用的 HLA-DQA1 位点的探针组合，尚属中等分辨率检测，若进行高分辨率检测，还需要设计更多的探针及进行探针的优化。而 HLA 基因分型的要求则视用途而定，就临床实质性组织器官移植而言，采用中分辨率的分型条件是最佳选择。因高分辨度将增加分型所需的时间和费用，且不易寻找到匹配的供者。但法医学上的个人鉴定则不同，确定唯一的等位基因型是其目的。本室研制的寡核苷酸芯片制作相对简单，易于操作，且稳定性好，特异性和灵敏度都能满足基因分型的需要，故适合5器官移植前的组织配型及疾病相关基因型检测等临床应用。在多次实验中，体会到探针连接，即水化的步骤至关重要，它对实验结果影响很大。水化过程中应注意保湿，
