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1、1广州地区汉族人群肺癌易感性标记物 CYP1A1、CYP2E1和 GSTM1 与肺癌关系的病例对照研究作者：王德全陈思东汪保国蔡旭玲冼雪珍【摘要】 目的探讨广州地区汉族人群谷胱苷肽硫转移酶（GSTM1） 、细胞色素 P4501A1（CYP1A1）和细胞色素 P4502E1（CYP2E1）基因多态性与肺癌易感性的关系。 方法选取中山大学附属第一医院、广州市肿瘤医院、广州市红十字会医院等医院的广州籍新发肺癌病人 91 例及同期上述各医院的同性别非肺部疾患病人 91 例作对照，采用聚合酶链式反应（PCR）和限制性片段长度多态性（RFLP）技术检测 CYP1A1、CYP2E1 和 GSTM1 的基因多
2、态性。 结果与野生型的CYP1A1 相比,突变型肺癌 OR 为 1.51(0.763.01),CYP2E1C2C2 基因型与 C1C1 基因型比较，其 OR 为 5.48(1.2125.23)，GSTM1 基因缺失型的 OR 值为1.26（0.692.30） ，而三者联合作用时，则可增加患肺癌的危险，其 OR 值为3.97(0.9416.79)，但无统计学意义（P0.05） 。 结论CYP1A1、CYP2E1和 GSTM1 的某些基因型增加了患肺癌的危险性，但尚未达到统计学的显著性水平,说明它们均不是肺癌个体易感性的主效基因，而是次效基因。【关键词】基因多态性肺肿瘤病例对照研究1 材料与方法1
3、.1 研究对象病例来源于广州市肿瘤医院、广州市红十字会医院、中山大学附属第一医院等 2000 年至 2001 年广州籍新发肺癌病人 91 例，其中男性 60 例，女性 31 例。年龄 22 岁84 岁。对照组 1：1 匹配来源于同期同一医院非肿瘤非肺部疾患的病人，性别相同，年龄2 岁。对照组 91 例，其中男性 60 例，女性 31 例，年龄最小 22 岁，最大 82 岁。两组间的年龄和性别的分布差异无显著性。1.2 样本的采集采集实验对象的静脉血 8ml10ml，于 4冰箱静置分离血清及血凝块，取血凝块于-70冰冻保存。1.3DNA 的制备新鲜血凝块或冰冻血凝块室温解冻后，采用 DNA 酚抽
4、提方法提取 DNA。1.4CYP1A1 基因型的检测2引物序列：5?鄄 CAGTGAAGAGGTGTAGCCGCT?鄄 3和：5?鄄TAGGAGTCTTGTCTCATGCCT?鄄 3，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR 反应体积及反应条件：ddH2O8.5l，10Buffer5.0l，dNTPs1.0l(0.01mol)，引物 2 种各10.0l（3.12510-5mol）(0.655M)，Taq 酶 0.5l（2.5U） ，模板5.0l。94预变性 2min，然后用 9450s（变性） 、5450s（退火） 、7260s（延伸） ，进行 30 个循环，最后 727min。PCR
5、扩增产物用 MSPI 酶切：扩增产物 10l， （10U）MsPI 内切酶 1l，10Buffer2l，ddH2O2l1000g，离心数秒，加石蜡 25l，37水浴 13h，65水浴 1015min 终止酶切，取 8l酶切产物点样用 1.8%琼脂凝胶作电泳分析。结果判断：野生型为 340bp，突变型 140，200bp2 个片段，杂合型为140，200，340bp3 个片段。1.5CYP2E1 基因多态性检测引物设计：CYP4502E1PstI/RsaI 型引物：5?鄄 CCAGTCGAGTCTACATTGTCA?鄄 3，5?鄄 TTCATTCTGTCTTCTAACTGG?鄄 3。PCR 反应
6、条件：ddH2O8.5l，10Buffer5.0l，dNTPs1.0l(0.01mol)，引物 4 种各 10.0l（3.12510-5mol） （0.655M） ，Taq 酶 0.5l（2.5U） ，模板 5.0l。94预变性 2min，然后用 9450s（变性） 、5450s（退火） 、7260s（延伸） ，进行 30 个循环，最后 727min。PCR 扩增产物的酶切:总体积15l：扩增产物 10l， （10U）RsaI 内切酶1l，10Buffer2l，ddH2O2l1000g，离心数秒，加石蜡 25l，37水浴13h，65水浴 1015min 终止酶切，取 8l 酶切产物点样用 1.
7、8%琼脂凝胶作电泳分析。结果判断：PCR 产物长度为 410bp，经 RsaI 酶切后，在紫外光下可见三种情况：出现 360bp 和 50bp 的两条亮带，此为 C1C1 野生型纯合子；只出现410bp 的亮带，此乃 C2C2 突变型纯合子；若出现上述的全部三条亮带，此为C1C2 杂合子。1.6GSTM1 基因多态性检测两对引物（见表 1）分别特异性扩增 GSTM1 基因片断（215bp）及参照基因?鄄 globin（?鄄珠蛋白、268bp） ，由上海生物工程公司合成。1.6.1PCR 扩增ddH2O18.5l，10Buffer5.0l，dNTPs1.0l(0.01mol)，引物 4 种，各
8、10.0l（3.12510-5mol） ，Taq 酶 0.75l（3.75U） ，模板 5.0l。94预变性 2min，然后用 9450s（变性） 、5450s（退火） 、7260s（延伸） ，进3行 30 个循环，最后 727min。1.6.2 琼脂扩电泳检测取 10l 反应物加样于 1.8%琼脂扩凝胶，电泳 30min，1%溴化乙锭（EB）染色，紫外光下可见 PCR 扩增的相应大小 DNA 片段的荧光带，即可判定结果。1.6.3 结果判定扩增产物分为 2 个基因型，GSTM1（+）紫外光下可见 2 条电泳带，即 268bp和 215bp，GSTM1（-）仅可见 268bp 带。1.7 数据
9、统计分析所有资料以 FOXPRO 建立数据库，用 SAS6.12 软件包进行统计分析。2 结果2.1CYP1A1 基因型与肺癌风险关系分析MSPI 识别的 CYP1A1 基因有三种类型，即突变型（纯合子） 、杂合型、野生型。它们在病例组的携带率见表 2。2.2CYP2E1 基因多态的频率分布及与肺癌风险关系本研究检测了 182 人，其中 C1C1 基因型者 114 人（62.64%） ，C1C2 者 59 人（32.42%） ，C2C2 型 9 人（4.95%） ，其中病例组与对照组的频率分布见表 3。杂合型变异的危险性最小，以其为参照组与两种纯合型比较进行肺癌风险的分析（表 3） 。2.3G
10、STM1 基因多态性与肺癌风险的关系GSTM1 等位基因型在病例和对照组中的频率分布见表 4。如果以常见的GSTM1 阳性（+/+，+/-）基因型个体的 OR 为 1，基因缺失个体的 OR 值为1.26（95%CI：0.692.30） 。2.4CYP1A1、GSTM1 基因多态联合作用与肺癌风险CYP1A1 基因型与 GSTM1 基因多态的联合作用与肺癌风险的关系分析结果见表 5。以上结果表明，当 CYP1A1 为突变型且 GSTM1 缺失时，发生肺癌的风险较大，OR 为 2.29，但经统计学检验差异无显著性（P0.05） 。2.5CYP2E1 与 GSTM1 联合作用与肺癌风险由于 C2C2
11、 型例数较少，将其合并至 C1C2 也不合理，因此，只是比较 C1C1和 C1C2 与肺癌风险的关系。结果表明 GSTM1 缺失型且携带 CYP2E1C1C1 基因型者4患肺癌的风险为 GSTM1 正常型的携带 CYP2E1C1C2 者的 2.13 倍（95%CI：0.825.56） （见表 6） 。2.6CYP1A1 基因型与 CYP2E1 基因型联合作用与肺癌风险关系由表 7 可见，突变型 CYP1A1 且具有 C1C1 的 CYP2E1 基因型者，患肺癌风险明显增大，OR 为 3.00(95%CI：1.038.78)，经统计学检验，差异具有显著性(2=4.0191，P0.05)。2.7C
12、YP1A1、CYP2E1、GSTM1 基因型联合作用与肺癌风险关系由表 8 可见，当 CYP1A1 为突变型、CYP2E1 为 C1C1 型且 GSTM1 为缺失型基因型者肺癌的风险最大，OR 为 3.97。3 讨论人类 CYP1A1 基因位于第 15 号染色体（q22?鄄 qter）上，CYP1A1 是一种肝外酶，在肺组织主要与多种化学物的代谢有关。本研究结果提示，广州地区汉族人群 CYP1A1C 型基因（突变型基因）频率为 39.56%，该突变率是目前国内同类研究中最高的，这与广州为全国肺癌高发区分布相一致，提示广州可能存在更多的导致肺癌发生的环境危险因素。但迄今还不清楚，这些 CYP1A
13、1C 型基因是先天遗传的还是后天的暴露刺激所产生的。CYP2E1 基因定位于人的第 10 号染色体上，CYP2E1 是外源性化学物质的活化酶，能催化许多物质的氧化还原反应，特别是亲水性小分子化合物，在化学致癌中，代谢激活各种癌前物质活性与癌症发生可能有一定关系。CYP2E1 多态性最常见的是 5区的 Pstl/Rsal 多态和内含子 6 的 Dral 多态。这种多态性差异的原因可能是遗传、环境因素或两者同时作用的结果。本次研究 Rsal 识别的 CYP2E1 等位基因有三种多态，即 C1C1、C1C2 和 C2C2型，C1C2 杂合型变异发生肺癌的风险最小，而与 C1C2 杂合型比较，C2C2
14、 基因型增加肺癌风险性，OR 为 5.48（95%CI：1.2125.23，P0.05） ，该结果与国内类似的研究报告不同，造成这种不同的原因很可能是不同地区环境因素差异所致。在单一易感基因的分析中，经常可以见到易感基因与肺癌风险之间无关联的结果，说明单一易感基因多态性与肺癌的关系是微弱的。但是不能根据这种无相关性或微弱的联系就否定它们在肺癌发生中的作用。目前认为肿瘤的形成是环境因素和遗传因素相互作用的结果，是一种由多个基因及环境因子综合引起的复杂5病，其主要特点是：参与发病的遗传因素可能达数十个，每个基因直接或间接地参与肿瘤的发病。每个基因参与发病的程度不同，大多数基因的作用较小或是微效的，
15、称之为次效基因。但可有一个或几个基因的作用呈明显的主效效应，此为主效基因。每个基因只赋予个体某种程度的易感性，没有其它基因或环境因素的参与，个体存在的单个易感基因并不一定致病，亦非致病所必需。各基因参与发病的机制可以是各自对不同生物学途径影响所致，即异质性。亦可以是对同一或相关生物学途径各自发生正性或负性相互作用综合影响结果。各基因致病效应之积累加上环境因子的作用构成个体的癌症的易患性。目前对肺癌易感基因（CYP450S 和 GSTMS）的研究均未发现主效基因，我们所研究的CYP1A1，CYP2E1 和 GSTM1 均未显示出对肺癌发病的主效效应，都是属于次效基因，对这种次效基因的危险性的评价，必须进行多种基因的联合作用的观察才能较为准确估计。相代谢酶（如 P450） 、相代谢酶（如 GSTM） 。与机体对环境中的化学致癌物、致突变物的易感性密切相关。因此，在决定某一化学物代谢酶多态性与肿瘤易感性的关系时，不仅要考虑它的单独作用，更要考虑它们的联合作用。CYP1A1 基因多态性与 GSTM1 基因多态性的联合研究结果表明，携带 CYP1A1突变型基因而 GSTM1 缺失者，患肺癌
