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1、1幽门螺杆菌毒素相关基因的克隆、测序及表达作者:韩锋产闫小君苏成芝【关键词】螺杆菌幽门细胞关键词:螺杆菌幽门细胞;毒素相关基因;基因克隆;基因表达;温度诱导摘要:目的分段扩增、克隆幽门螺杆菌毒素相关基因 cagA 中间区cag1,cag2,并利用大肠杆菌系统表达.方法 PCR 法扩增 cagA 基因,双脱氧中止法测序正确后,克隆入大肠杆菌表达载体 pBV220,受控于 PRPL 启动子,转化大肠杆菌 DH5,42进行温度诱导.结果 PCR 分段扩增出 cagA 中间区基因cag1,cag2,分别为 975,755bp,克隆入 pUC19 质粒,测序正确;在 pBV 中构建cag1,cag2 的
2、重组表达载体 pBVcagA1,pBVcagA2,工程菌诱导后 SDS-PAGE 显示新生表达蛋白带,Mr:Cag136103,Cag227.9103,均与预期的 cagA 蛋白 Mr一致,约占菌体总蛋白的 36%和 24%.结论成功克隆分段扩增的 cagA 中间区基因,并可在大肠杆菌 DH5 中高效表达.Keywords:Helicobacterpylori;cytotoxin-associatedgene(cagA);genecloning;geneexpression;temper-atureinduceAbstract:AIMToamplifyandclonethemiddleregi
3、onofHelicobacterpyloricagAgene,andexpresstheproteinsinE.coli.METHODSAfterthecag1andcag2wereamplifiedbyPCRandsequencdbydideoxymethods,theywereinsert-edintoexpressionvectorpBV220inwhichexogenousgenewascontrolledbyPRPLpromoters.TherecombinantplasmidspBVcag1andpBVcag2weretransformedintoE.coliDH5andinduc
4、edat42respectivelytoexpresstheencodedproteins.RESULTSThemiddleregionofcagAwasamplifiedand975,755bpproductsweregotascag1,cag2,whichwereclonedintopUC19andsequencedcorrectly.Then,theirrecombinationexpressionclonespBVcagA1andpBVcagA2wereconstructed.Whentheirengineeredbacterawerein-duced,theanticipatedMr
5、36103and27.9103proteinsbandappearedonSDS-PAGEgelandamountedto36%and24%oftotalbacterialproteinrespectively.CONCLUSIONTheH.pyloricagAmiddleregionmightbesuccessfullyclonedandefficientlyexpressedfractionallyinE.coli.0 引言毒素相关基因 A(cytotoxin-associatedgene,cagA)基因是 cag 致病岛的一部分,其 OFR 约 3542bp 左右,3端存在变异,相应蛋白
6、 Mr 为(1.281.40)1051 ,是胃内致病微生物幽门螺杆菌(Hp)主要的毒力因子之一,参与胃、十二指肠溃疡及胃癌等的发病,并与疾病的转归有关2-4.中国 Hp 感染率高达 80%以上,且大多为 cagA+Hp 的感染5.现在一些 Hp 标准菌株的 cagA 基因已克隆6,7 ,其表达产物 cagA 具有较强的抗原性,其滴度2可反应 Hp 株间的毒力差异,而且和疾病发展也有一定的相关性1.对 Hp 感染的检测可通过对抗 cagA 抗体的检测进行.将 cagA 分段表达,同时用来检测患者血清,可以更全面、准确、清晰地了解患者 Hp 的感染情况.我们利用原核表达系统分段克隆表达 cagA
7、基因中间区,为 Hp 感染的检测及治疗提供基础.1 材料和方法1.1 材料大肠杆菌 JM109,DH5,pUC19 及 pBV220 质粒为本所保存;pMC3 为含 cagA 基因 5端大部分的 pBluescript 质粒,由美国 Vanderlilt 大学Tummuru 博士惠赠.限制性内切酶、连接酶、核酸修饰酶及 Taq 酶均为宝生物公司产品.1.2 方法据标准菌株 cagA 序列6,7设计 PCR 引物,进行分段扩增:cag1 正向 ACAGAATTCATGGACATGGATCCCAATTACAAGT 反向GTTGTCGACTTACTCGTCATAGTTGCCTGTGTTcag2 正向
8、 AGAGGATCCATGGAGGTGAAACGAGCTCAG 反向TCACTGCAGTGGCCTCTATTCCAGATAACCcag1 正向引物加起始码(ATG)及 EcoRI 酶切位点,反向引物上加终止码(TAA)及 SalI 酶切位点;cag2 正向引物加起始码(ATG)及 BamHI 酶切位点,反向引物上加终止码(TAA)及 PstI 酶切位点.以 pMC3 为模板,反应条件为955min,941min,551min,721min.PCR 产物克隆及鉴定用EcoRI+SalI(cag1) ,BamHI+PstI(cag2)分别双酶切纯化的 PCR 产物与 pUC19质粒,连接外源 DN
9、A 与对应线性化 pUC19 质粒,转化 E.coliJM109,氨苄青霉素抗性及蓝白筛选,挑选白色克隆,酶切鉴定重组克隆.核苷酸序列由基康公司测序.H.pyloricag1,cag2 与表达载体的重组.目的蛋白的诱导表达:工程菌在含氨苄青霉素(100mgL-1)的 LB 培养液中30振荡过夜,次日按 1%转接扩大培养,继续 30振荡 24h,当 A600nm=0.6时,立即转入 42水浴摇床快速振荡 5h.SDS 聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE):4离心收集菌体,用含 3mLL-1 巯基乙醇载样液处理(10068min) ,考马斯亮蓝 R-250 染色.2 结果PCR 扩增 cag1,
10、cag2,分别得到 975 和 755bp 的片段(Fig1).随机挑选白色克隆,经双酶切鉴定,证实含有 975 和 755bp 的插入片段(Fig2).阳性克隆送交基康公司测序,测序正确.2.1pBVcag1,pBVcag2 表达质粒的构建用 EcoRI+SalI(c1) ,BamHI+PstI(c2)分别酶切 pUC19-c1,pUC-c2 重组克隆和 pBV220,经回收分别得到 cag1,cag2 基因和线性化 pBV220,连接外源 DNA 和线性化 pBV220,转化DH5 感受态细胞,氨苄青霉素抗性筛选,挑选菌落培养,提取质粒酶切鉴定,得到正确重组克隆 pBV-cag1,pBV-
11、cag2(Fig3).32.2cagA 在大肠杆菌中的表达 pBV-cag1,pBV-cag2 重组质粒以大肠杆菌DH5 宿主菌,按方法进行温度诱导,42诱导培养的工程菌经还原处理后作SDS-PAGE,考马斯亮蓝染色,与对照菌株比较,工程菌在Mr36103,27.9103 处各出现一条明显的新生蛋白带,其含量随诱导时间延长而增加,56h 达高峰,而后趋于稳定,6h 诱导工程菌电泳薄层扫描显示目的蛋白约占菌体总蛋白的 36%和 24%(Fig4).图 1图 2 略3 讨论Hp 主要寄居在胃幽门附近的胃窦粘膜上,故名幽门螺杆菌.它可释放多种毒性酶类(如尿素酶、脂酶、粘液酶等)和毒素引起对胃粘膜屏障
12、的损害,还能使机体产生炎症和免疫反应,增加胃泌素的分泌,最终导致疾病形成.Hp 的基因具有高度多态性,不同个体不同地区源性的 Hp 毒力不同;50%以上的 Hp 菌株可释放空泡毒素(VacA)和毒素相关蛋白(CagA) ,这种 Hp 被称为产毒型 Hp,又称 I型 Hp8 ,其致病力更强,通过患者血中 CagA 抗体检测可诊断是否为这种产毒型 Hp 感染9.cagA+Hp 是活动性胃炎及消化性溃疡的主要病因之一;在欧美,cagA+Hp 的感染已被认为是胃癌可能发生的先兆,但在 cagA+Hp 感染率很高的亚洲,这种联系并不紧密5,10.但已证实的是,Hp 可抑制胃粘膜上皮细胞的增殖,cagA+
13、Hp 抑制作用明显弱于 cagA-Hp,原因在于 cagA+Hp 可损伤胃粘膜上皮细胞使其持续增殖,提示 cagA+Hp 和胃癌相关11.研究还发现,97%胃腺癌患者为 cagA+Hp 感染者;和 cagA-Hp 感染相比,cagA+的 Hp 感染可明显降低胃液中的 Vit.C 的水平,从而刺激胃癌的发生12.也有报道认为,cagA+Hp 感染和胃癌的发生没有关联5.此外,cagA+Hp 感染还与功能性消化不良,低度恶性胃粘膜淋巴组织(MALT)淋巴瘤等相关;在 Hp 感染后出现的 MALT 淋巴瘤在根除 Hp 感染后可以消退2-4,8.cagA+的 Hp 菌株都表达 CagA 蛋白,感染后产
14、生可测的抗体反应5 ,CagA 抗体的存在提示患者可能存在高危的或更严重的疾病.在儿童中,高滴度的 CagA 抗体反应伴随较严重的感染13.Hp 血清反应阳性与胃癌阶段也有一定的关系,晚期癌症患者对 CagA 的免疫反应明显受抑制,胃癌早期患者可出现强阳性反应14 ,因此,CagA 抗体的检测十分重要.图 3 略pBV220 为含 PRPL 启动子的原核高效表达载体,它同时含有温度敏感阻抑物cI 调控基因,多酶切位点和两个强的转录终止序列,全长 3.66kb9.为使cagA 获得高效表达,我们选择 pBV220 非融合蛋白表达载体,用EcoRI+SalI(c1) ,BamHI+PstI(c2)
15、酶切 pUC/cagA,回收酶切目的片段,克隆入 pBV220 中,重组基因受控于温度诱导启动子 PRPL,基因起始密码子 ATG 与 SD序列之间的长度为 713bp,距离合适,结构利于 mRNA 翻译起始,因此重组质粒得以在宿主菌中高效表达.SDS-PAGE 显示温度诱导表达出 Mr36000,27900 的单体蛋白,与预期 CagA1,CagA2 的 Mr 一致.表达产物占菌体蛋白的 36%和 24%.这将为发展简便、廉价的免疫学诊断 cagA+Hp 感染的方法及抗 CagA+Hp 疫苗的制4备奠定基础.图 4 略参考文献:1YamaokaY,KodamaT,KashimaK,Graha
16、mDY.Variantsofthe3regionofthecagAgeneinHelicobacterpyloriisolatesfrompatientswithdifferentH.pylori-associateddiseasesJ.JClinMicrobiol,1998;36(8):2258-2263.2RuggeM,BusattoG,CassaroM,ShiaoYH,RussoV,Lean-droG,AvelliniC,FabianoA,SidoniA,CovacciA.Patientsyoungerthan40yearswithgastriccarcinoma:Helicobacterpy-lorigenotypeandassociatedgastritisphenotypeJ.Cancer,1999;85(12):2506-2511.3EvansDG,QueirozDM,MendesE