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1、1幽门螺杆菌毒素相关基因的克隆、测序及表达作者：韩锋产闫小君苏成芝【关键词】螺杆菌幽门细胞关键词:螺杆菌幽门细胞;毒素相关基因;基因克隆;基因表达;温度诱导摘要:目的分段扩增、克隆幽门螺杆菌毒素相关基因 cagA 中间区cag1，cag2，并利用大肠杆菌系统表达.方法 PCR 法扩增 cagA 基因，双脱氧中止法测序正确后，克隆入大肠杆菌表达载体 pBV220，受控于 PRPL 启动子，转化大肠杆菌 DH5，42进行温度诱导.结果 PCR 分段扩增出 cagA 中间区基因cag1，cag2，分别为 975，755bp，克隆入 pUC19 质粒，测序正确;在 pBV 中构建cag1，cag2 的
2、重组表达载体 pBVcagA1，pBVcagA2，工程菌诱导后 SDS-PAGE 显示新生表达蛋白带，Mr:Cag136103，Cag227.9103，均与预期的 cagA 蛋白 Mr一致，约占菌体总蛋白的 36%和 24%.结论成功克隆分段扩增的 cagA 中间区基因，并可在大肠杆菌 DH5 中高效表达.Keywords:Helicobacterpylori;cytotoxin-associatedgene（cagA）;genecloning;geneexpression;temper-atureinduceAbstract:AIMToamplifyandclonethemiddleregi
3、onofHelicobacterpyloricagAgene，andexpresstheproteinsinE.coli.METHODSAfterthecag1andcag2wereamplifiedbyPCRandsequencdbydideoxymethods，theywereinsert-edintoexpressionvectorpBV220inwhichexogenousgenewascontrolledbyPRPLpromoters.TherecombinantplasmidspBVcag1andpBVcag2weretransformedintoE.coliDH5andinduc
4、edat42respectivelytoexpresstheencodedproteins.RESULTSThemiddleregionofcagAwasamplifiedand975，755bpproductsweregotascag1，cag2，whichwereclonedintopUC19andsequencedcorrectly.Then，theirrecombinationexpressionclonespBVcagA1andpBVcagA2wereconstructed.Whentheirengineeredbacterawerein-duced，theanticipatedMr
5、36103and27.9103proteinsbandappearedonSDS-PAGEgelandamountedto36%and24%oftotalbacterialproteinrespectively.CONCLUSIONTheH.pyloricagAmiddleregionmightbesuccessfullyclonedandefficientlyexpressedfractionallyinE.coli.0 引言毒素相关基因 A（cytotoxin-associatedgene，cagA）基因是 cag 致病岛的一部分，其 OFR 约 3542bp 左右，3端存在变异，相应蛋白
6、 Mr 为（1.281.40）1051 ，是胃内致病微生物幽门螺杆菌（Hp）主要的毒力因子之一，参与胃、十二指肠溃疡及胃癌等的发病，并与疾病的转归有关2-4.中国 Hp 感染率高达 80%以上，且大多为 cagA+Hp 的感染5.现在一些 Hp 标准菌株的 cagA 基因已克隆6，7 ，其表达产物 cagA 具有较强的抗原性，其滴度2可反应 Hp 株间的毒力差异，而且和疾病发展也有一定的相关性1.对 Hp 感染的检测可通过对抗 cagA 抗体的检测进行.将 cagA 分段表达，同时用来检测患者血清，可以更全面、准确、清晰地了解患者 Hp 的感染情况.我们利用原核表达系统分段克隆表达 cagA
7、基因中间区，为 Hp 感染的检测及治疗提供基础.1 材料和方法1.1 材料大肠杆菌 JM109，DH5，pUC19 及 pBV220 质粒为本所保存;pMC3 为含 cagA 基因 5端大部分的 pBluescript 质粒，由美国 Vanderlilt 大学Tummuru 博士惠赠.限制性内切酶、连接酶、核酸修饰酶及 Taq 酶均为宝生物公司产品.1.2 方法据标准菌株 cagA 序列6，7设计 PCR 引物，进行分段扩增:cag1 正向 ACAGAATTCATGGACATGGATCCCAATTACAAGT 反向GTTGTCGACTTACTCGTCATAGTTGCCTGTGTTcag2 正向
8、 AGAGGATCCATGGAGGTGAAACGAGCTCAG 反向TCACTGCAGTGGCCTCTATTCCAGATAACCcag1 正向引物加起始码（ATG）及 EcoRI 酶切位点，反向引物上加终止码（TAA）及 SalI 酶切位点;cag2 正向引物加起始码（ATG）及 BamHI 酶切位点，反向引物上加终止码（TAA）及 PstI 酶切位点.以 pMC3 为模板，反应条件为955min，941min，551min，721min.PCR 产物克隆及鉴定用EcoRI+SalI（cag1） ，BamHI+PstI（cag2）分别双酶切纯化的 PCR 产物与 pUC19质粒，连接外源 DN
9、A 与对应线性化 pUC19 质粒，转化 E.coliJM109，氨苄青霉素抗性及蓝白筛选，挑选白色克隆，酶切鉴定重组克隆.核苷酸序列由基康公司测序.H.pyloricag1，cag2 与表达载体的重组.目的蛋白的诱导表达:工程菌在含氨苄青霉素（100mgL-1）的 LB 培养液中30振荡过夜，次日按 1%转接扩大培养，继续 30振荡 24h，当 A600nm=0.6时，立即转入 42水浴摇床快速振荡 5h.SDS 聚丙稀酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）:4离心收集菌体，用含 3mLL-1 巯基乙醇载样液处理（10068min） ，考马斯亮蓝 R-250 染色.2 结果PCR 扩增 cag1，
10、cag2，分别得到 975 和 755bp 的片段（Fig1）.随机挑选白色克隆，经双酶切鉴定，证实含有 975 和 755bp 的插入片段（Fig2）.阳性克隆送交基康公司测序，测序正确.2.1pBVcag1，pBVcag2 表达质粒的构建用 EcoRI+SalI（c1） ，BamHI+PstI（c2）分别酶切 pUC19-c1，pUC-c2 重组克隆和 pBV220，经回收分别得到 cag1，cag2 基因和线性化 pBV220，连接外源 DNA 和线性化 pBV220，转化DH5 感受态细胞，氨苄青霉素抗性筛选，挑选菌落培养，提取质粒酶切鉴定，得到正确重组克隆 pBV-cag1，pBV-
11、cag2（Fig3）.32.2cagA 在大肠杆菌中的表达 pBV-cag1，pBV-cag2 重组质粒以大肠杆菌DH5 宿主菌，按方法进行温度诱导，42诱导培养的工程菌经还原处理后作SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色，与对照菌株比较，工程菌在Mr36103，27.9103 处各出现一条明显的新生蛋白带，其含量随诱导时间延长而增加，56h 达高峰，而后趋于稳定，6h 诱导工程菌电泳薄层扫描显示目的蛋白约占菌体总蛋白的 36%和 24%（Fig4）.图 1图 2 略3 讨论Hp 主要寄居在胃幽门附近的胃窦粘膜上，故名幽门螺杆菌.它可释放多种毒性酶类（如尿素酶、脂酶、粘液酶等）和毒素引起对胃粘膜屏障
12、的损害，还能使机体产生炎症和免疫反应，增加胃泌素的分泌，最终导致疾病形成.Hp 的基因具有高度多态性，不同个体不同地区源性的 Hp 毒力不同;50%以上的 Hp 菌株可释放空泡毒素（VacA）和毒素相关蛋白（CagA） ，这种 Hp 被称为产毒型 Hp，又称 I型 Hp8 ，其致病力更强，通过患者血中 CagA 抗体检测可诊断是否为这种产毒型 Hp 感染9.cagA+Hp 是活动性胃炎及消化性溃疡的主要病因之一;在欧美，cagA+Hp 的感染已被认为是胃癌可能发生的先兆，但在 cagA+Hp 感染率很高的亚洲，这种联系并不紧密5，10.但已证实的是，Hp 可抑制胃粘膜上皮细胞的增殖，cagA+
13、Hp 抑制作用明显弱于 cagA-Hp，原因在于 cagA+Hp 可损伤胃粘膜上皮细胞使其持续增殖，提示 cagA+Hp 和胃癌相关11.研究还发现，97%胃腺癌患者为 cagA+Hp 感染者;和 cagA-Hp 感染相比，cagA+的 Hp 感染可明显降低胃液中的 Vit.C 的水平，从而刺激胃癌的发生12.也有报道认为，cagA+Hp 感染和胃癌的发生没有关联5.此外，cagA+Hp 感染还与功能性消化不良，低度恶性胃粘膜淋巴组织（MALT）淋巴瘤等相关;在 Hp 感染后出现的 MALT 淋巴瘤在根除 Hp 感染后可以消退2-4，8.cagA+的 Hp 菌株都表达 CagA 蛋白，感染后产
14、生可测的抗体反应5 ，CagA 抗体的存在提示患者可能存在高危的或更严重的疾病.在儿童中，高滴度的 CagA 抗体反应伴随较严重的感染13.Hp 血清反应阳性与胃癌阶段也有一定的关系，晚期癌症患者对 CagA 的免疫反应明显受抑制，胃癌早期患者可出现强阳性反应14 ，因此，CagA 抗体的检测十分重要.图 3 略pBV220 为含 PRPL 启动子的原核高效表达载体，它同时含有温度敏感阻抑物cI 调控基因，多酶切位点和两个强的转录终止序列，全长 3.66kb9.为使cagA 获得高效表达，我们选择 pBV220 非融合蛋白表达载体，用EcoRI+SalI（c1） ，BamHI+PstI（c2）
15、酶切 pUC/cagA，回收酶切目的片段，克隆入 pBV220 中，重组基因受控于温度诱导启动子 PRPL，基因起始密码子 ATG 与 SD序列之间的长度为 713bp，距离合适，结构利于 mRNA 翻译起始，因此重组质粒得以在宿主菌中高效表达.SDS-PAGE 显示温度诱导表达出 Mr36000，27900 的单体蛋白，与预期 CagA1，CagA2 的 Mr 一致.表达产物占菌体蛋白的 36%和 24%.这将为发展简便、廉价的免疫学诊断 cagA+Hp 感染的方法及抗 CagA+Hp 疫苗的制4备奠定基础.图 4 略参考文献:1YamaokaY，KodamaT，KashimaK，Graha
16、mDY.Variantsofthe3regionofthecagAgeneinHelicobacterpyloriisolatesfrompatientswithdifferentH.pylori-associateddiseasesJ.JClinMicrobiol，1998;36（8）:2258-2263.2RuggeM，BusattoG，CassaroM，ShiaoYH，RussoV，Lean-droG，AvelliniC，FabianoA，SidoniA，CovacciA.Patientsyoungerthan40yearswithgastriccarcinoma:Helicobacterpy-lorigenotypeandassociatedgastritisphenotypeJ.Cancer，1999;85（12）:2506-2511.3EvansDG，QueirozDM，MendesE
