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1、学位论文原创性声明本论文是我个人在导师指导下进行的工作研究及取得的研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在论文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。作者签名：日期：年月日学位论文使用授权声明本人授权汕头大学保存本学位论文的电子和纸质文档，允许论文被查阅和借阅；学校可将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存和汇编论文；学校可以向国家有关部门或机构送交论文并授权其保存、借阅或上网公布本学位论文的全部或部分内容。对于保密的论文，按照保
2、密的有关规定和程序处理。作者签名：导师签名：日期：年月日日期：年月日汕头大学医学院硕士学位论文固相萃取-反相高效液相色谱法同时测定人血浆中五种苯二氮卓类药物浓度及其临床应用研究生：郑付春导师：谭学瑞教授汕头大学医学院第一附属医院药剂科摘要苯二氮卓类药物为镇静、催眠、抗焦虑的临床首选药物，具有镇静催眠、抗焦虑、抗惊厥、抗癫痫、中枢性肌松等中枢神经系统抑制的药理作用。尽管有效安全，但长期使用该类药物仍可致耐受性、依赖性，突然停药也会引起撤药综合征；且大剂量可损害患者的近期记忆，引起暂时性的健忘症，也可引起患者外周神经肌肉阻断等。本类药物与其它药物存在着相互作用，如：乙醇可增强苯二氮卓类药物的不良反
3、应等。苯二氮卓类药物一次滥用或长期使用都有可能引起急性或慢性中毒，特别是与其他镇静剂混合使用时，中毒的可能性更大，因而也是急诊药物中毒的常见药物。而且，与麻醉药品相比，苯二氮卓类药物品种繁多，较易获得，使用广泛，易致滥用和依赖。因此建立快速、简便、准确的体内苯二氮卓类药物分析检测方法具有重要实用价值和意义，不仅可应用于临床对这类药物进行治疗药物监测，观察疗效与不良反应，以支持神经、精神疾病的合理、安全用药，而且也能为中毒药物分析提供依据。地西泮、奥沙西泮、氯硝西泮、三唑仑和阿普唑仑是临床常用的五种苯二氮卓类药物。本类药物结构相似，极性相近，同时分离和测定此类药物有一定难度；且生物样品量一般都较
4、少，而血样中本类药物的含量往往非常低（血药浓度一般在 ng/mL - ug/mL之间）；有的药物如地西泮还会在体内产生奥沙西泮等一系列活性代谢产物，血液中药物原形、体内代谢产物与大量内源性干扰物质并存。因此，如何对样本进行预处理，以减少杂质干扰，并对痕量组分进行提取、分离、富集，以提高分析方法的灵敏度显得尤为重要。气-质联用或液-质联用用于分析本类药物，但由于仪器昂贵，很难在临床得到广泛应用。高效液相色I汕头大学医学院硕士学位论文谱法广泛地应用于分析体内本类药物，具有快速、分离效果好、准确度高的优点。现有的研究报道多是对其中一些药物的测定，但没有同时测定其活性代谢产物（如奥沙西泮），且多用传统
5、的液-液萃取法预处理血液样本。而且有的方法较适合法医学鉴定：用的样本量较大，灵敏度较低，不适合于治疗药物监测。本文旨在建立专属性强、灵敏度高、重现性好、准确可靠、操作简便的固相萃取法预处理血液样本，及等度洗脱的反相高效液相色谱法，用二极管阵列检测器同时测定人血浆中五种苯二氮卓类药物，并以三环类抗抑郁药氯丙咪嗪为内标，快速分析体内本类药物的浓度。本文含二个部分：以高效液相色谱法-二极管阵列检测器同时分析测定五种临床常用苯二氮卓类药物的血药浓度；用固相萃取法对人血浆样品进行预处理。一、高效液相色谱法-二极管阵列检测器同时分析测定五种临床常用苯二氮卓类药物的血药浓度方法：采用内标法定量。色谱条件如下
6、：色谱柱：XTerra C8 RP（4.6150mm，5um）分析柱，Waters公司预柱：Zobax-Extend C18（4.610mm，5um），Agilent公司流动相：乙腈：50mM磷酸缓冲液（pH3.0）= 26.8：73.2（v/v）流速：1.2mL/min柱温：45DAD检测器：220nm进样量：50uL结果：结果显示，被测五个药物的日内误差（RSD）为 2.2% - 12.6%，日间误差（RSD）为 2.1% - 13.0%。在较宽的范围内均呈良好的线性关系：奥沙西泮（7.5 2000 ng/mL）、地西泮（7.5 500 ng/mL）、氯硝西泮、阿普唑仑及三唑仑（5 200
7、 ng/mL），相关系数均在 0.9994以上。地西泮的最低检测限为 3.2ng/mL，奥沙西泮的最低检测限为2.2ng/mL，氯硝西泮的最低检测限为 1.1ng/mL，阿普唑仑的最低检测限为 1.5ng/mL，三唑仑的最低检测限为 1.4ng/mL。结论：建立了等度洗脱的高效液相色谱法，可以在 21min内同时分离测定五种苯二氮卓类药物，并以三环类抗抑郁药氯丙咪嗪为内标，方法操作简便、快速、精密度好、结果准确可靠，适于临床对血浆样本中这类药物含量的分析测定。II汕头大学医学院硕士学位论文二、建立固相萃取法预处理血浆样品方法：采用 C1 cartridges（100 mg，1 mL，Agile
8、nt公司），对血浆样本进行预处理，以提取、分离、富集待测药物。柱子依次用 5mL甲醇、5mL去离子水，进行活化、平衡后，用 pH=7的磷酸缓冲液稀释血样上柱；依次用 1mL水、1mL水/甲醇混合液（80:20 v/v）洗去杂质；用2mL甲醇洗脱、收集被测物；洗脱液在 45氮气下吹干，用流动相定容至 125uL；离心，5，13000 rpm x 5min，取上清液以备进样。结果：六种药物（包括内标氯丙咪嗪）的提取回收率为 81 - 101%，RSD为 2.1- 13 %。地西泮的最低检测限为 3.2ng/mL，奥沙西泮的最低检测限为 2.2ng/mL，氯硝西泮的最低检测限为 1.1ng/mL，阿
9、普唑仑的最低检测限为 1.5ng/mL，三唑仑的最低检测限为 1.4ng/mL。结论：建立了固相萃取法对血浆样本进行预处理，可以有效提取样本中五种苯二氮卓类药物及内标氯丙咪嗪，回收率较高；选择性较高，有效去除内源性干扰；将待测药物的浓度提高为原来的 4倍，提高了分析方法的灵敏度。本方法操作简便、精密度好、结果准确可靠，适于临床对血浆样本中此类药物含量的分析测定。关键词：高效液相色谱法，固相萃取法，苯二氮卓类药物，地西泮，奥沙西泮，氯硝西泮，阿普唑仑，三唑仑。III汕头大学医学院硕士学位论文Simultaneous Determination of Five Benzodiazepines in
10、 HumanPlasma by Solid Phase Extraction & RP-HPLCABSTRACTBenzodiazepines (BZDs) possess sedative, hypnotic, anxiolytic, anticonvulsant andmuscle relaxant actions, which are the first choice for clinical use in a variety ofindications such as insomnia, anxiety, seizures, and so on. In general, BZDs ar
11、e safeand effective in short term, while long-term usage prone to cause tolerance, physicaldependence, and a withdrawal syndrome upon discontinuation; large dosage can causecognitive or memory impairments, and the potential for toxicity increases whencombined with other central nervous system depres
12、sants such as alcohol, opiates ortricyclic antidepressants. BZDs are commonly misused and taken in combination withother drugs of abuse. Thus, it is important to develop feasible and widely applicableanalytical methods for the analysis of BZDs, which should be able to discriminatebetween the differe
13、nt drugs even if they are co-administered and/or taken as part ofpoly-pharmacy regimen such as during antidepressant therapy, finally supporting safeand effective therapy for patients.Several BZDs including diazepam, oxazepam, clonazepam, triazolam andalprazolam are commonly used in clinic. When giv
14、en in therapeutical doses, plasmalevels of different BZDs can range from a few nanograms per milliliter (e. g. for triazolam)to 12 ug/mL (e. g. for oxazepam). BZDs are mainly metabolized in liver by cytochromeP450 enzymes which produce dealkylated and hydroxylated analogues; several of thesecompounds (e.g. oxazepam) still retain a strong pharmacological activity. So, samplepretreatment is very importan
