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1、三、色谱法 概述与分类 根据两相所处状态: 液相色谱和气相色谱； 根据色谱机理: 吸附色谱、分配色谱、凝胶 过滤色谱、大孔吸附树脂与离子交换色谱等； 根据操作方法: TLC（薄层色谱）、柱色谱 与纸色谱等,（ ）,（一）吸附色谱 (adsorption chromatography) 1.原理：依据吸附剂对混合物中各成分吸附 性能的不同，使各成分得到分离。 2.常用吸附剂： 硅胶、氧化铝、活性炭与聚酰胺. 3.固-液吸附可分为: 物理吸附 化学吸附 半化学吸附。,4、物理吸附的特点： 无选择性; 吸附与解吸是可逆的; 速度快; 实际应用最多。 5、化学吸附的特点： 具有选择性； 吸附十分牢固,
2、有时甚至是不可逆的。 化学吸附用得少.,6、半化学吸附的特点： 介于物理吸附与化学吸附之间的吸附过程,其吸附力较弱。 半化学吸附有一定应用价值。 例如:聚酰胺与黄酮类、醌类等酚性化合物 之间的氢键吸附属于半化学吸附.,7、物理吸附的基本规律 常用的物理吸附剂： 硅胶、氧化铝（极性吸附剂） 活性炭（非极性吸附剂） 极性吸附剂对极性物质具有较强的亲和能 力(极性强的溶质将被优先吸附),Rf值小 Rf值 = 起始线至斑点中心的距离 起始线至溶剂前沿的距离, 溶剂极性越弱，则极性吸附剂对溶质表现出的吸附能力就越强。 洗脱溶剂的极性增强，则极性吸附剂对溶质的吸附能力随之减弱。 溶质即使被极性吸附剂吸附，
3、但一旦加入极性较强的溶剂时，溶质即被溶剂置换下来。 非极性吸附剂活性炭的吸附能力与极性吸附剂硅胶、氧化铝恰好相反。,活性炭对非极性溶质在水中表现出较强的 吸附能力。 b.当（洗脱）溶剂的极性降低时，则活性炭对 非极性溶质的吸附能力随之减弱； c.从活性炭柱上洗脱被吸附物质时，溶剂的洗 脱能力将随溶剂极性的降低而增强。,8极性及其强弱判断 (1).化合物的极性：按下列官能团的顺序增强 -CH2-CH2-，-CH=CH-，-OCH3，-COOR， C=O，-CHO，-NH2，-OH，-COOH, 化合物的极性：由分子中所含官能团的 种类、数量及排列方式等综合因素决定。,极性增强方向,例如：黄花夹竹
4、桃七种强心苷成分结构通式,（ ）,黄花夹竹桃果实中的强心苷成分,（2）溶剂的极性:与介电常数大小一致 环己烷 1.88 苯 2.29 无水乙醚 4.47 氯仿 5.20 乙酸乙酯 6.11 乙醇 26.0 甲醇 31.2 水 81.0,极性递增,9. 吸附柱色谱法在物质分离中的应用 （1）吸附柱的选择：酸性物质分离宜用硅胶 柱，碱性物质分离选用氧化铝柱。 （2）吸附剂的使用情况 用量： 为样品量的30-60倍 规格： 100目左右 规格： 15:120:1（高度:直径） （3）装柱：尽可能选用极性小的溶剂溶解样品及其装柱。,（4）洗脱剂的选择 一般选用TLC展开时使组分Rf值达到 0.20.3
5、的溶剂系统。 实际多用混合有机溶剂系统进行洗脱。 分离酸性物质时，常在洗脱溶剂中加入 少量醋酸； 分离碱性物质时，则在洗脱溶剂中加入 少量氨水或吡啶或二乙胺。, 按照极性增强顺序，常用混合洗脱溶剂 体系如下： (己烷/苯) (苯/乙醚) (苯/乙酸乙酯) (氯仿/乙醚) (氯仿/乙酸乙酯) (氯仿/甲醇) (丙酮/水) （甲醇/水）,10、聚酰胺吸附色谱法 （1）吸附原理： 通过分子中的酰胺羰基与酚类、黄酮类 化合物的酚羟基，或以酰胺键上的游离胺基 与醌类、脂肪酸上的羰基形成氢键缔合而产 生吸附。 （2）适用范围： 极性物质与非极性物质分离均适用。,（3）聚酰胺吸附能力的强弱： 取决于各种化合
6、物与聚酰胺形成氢键缔合的能力。 化合物在水溶剂中聚酰胺吸附规律： a. 形成氢键的基团数目越多，则吸附能力越强,Rf值越小。,b. 成键位置对吸附力有影响。,c. 分子结构中芳香化程度高，则吸附性增强；反之，则减弱。,（4）装柱：通常用水装柱 （5）洗脱剂 各种溶剂由弱至强的洗脱能力大致如下：,（ ）,水甲醇丙酮氢氧化钠水溶液甲酰胺 二甲基甲酰胺尿素水溶液 最常应用的洗脱系统：乙醇/水 （6）应用范围： a.特别适合于酚类、黄酮类物质制备和分离。 b.脱鞣质处理； c.也可用于生物碱、萜类、甾类、糖类、氨基 酸等物质的分离。,11.大孔吸附树脂 （1）吸附原理：大孔吸附树脂是吸附性和分子筛性原
7、理相结合的分离材料。 （2）组成： 非极性型以苯乙烯为母体，二乙烯苯为交联剂； 中极性型以2-甲基苯烯酸甲酯为母体，二乙烯苯为交联剂。,（3）影响吸附的因素 A、非极性化合物在水中易被非极性大孔树脂吸附；极性化合物在水中易被极性大孔树脂吸附。 B、物质在溶剂中的溶解度大，树脂对此物质的吸附力就小；反之就大。 C、能与大孔吸附树脂形成氢键的化合物易被吸附。,（4）洗脱液的选择 A、洗脱液:甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等。 （乙醇/水）最常用。 B、对于非极性大孔吸附树脂，洗脱液极性越小，洗脱能力越强； C、对于中极性的大孔吸附树脂和极性较强的化合物，洗脱液应选用极性较大的溶剂。,（5）应用范围 A
8、、苷类与糖类的分离； B、生物碱的精制； C、多糖、黄酮类、三萜类化合物的分离等。 注意事项： A、大孔吸附树脂使用前需要用乙醇预处理； B、水溶液上柱，醇梯度洗脱。,（二）分配色谱 (partition chromatography) 1、正相分配色谱 （1）固定相：水、缓冲溶液等强极性溶剂。 （2）流动相：氯仿、乙酸乙酯、丁醇等弱极 性有机溶剂。 （3）适用范围：用于分离水溶性或极性较大 的成分，如生物碱、苷类、糖类、有机酸等。,（4）洗脱顺序：化合物极性越小，越先出柱；化合物极性越大，越后出柱。 2、反相分配色谱 (reverse phase partition chromatograp
9、hy) （1）固定相：石蜡油等弱极性有机溶剂。 （2）流动相：水、甲醇等强极性有机溶剂 （3）应用：适合于分离脂溶性化合物，如高级脂肪酸、油脂、游离甾体等。,（4）洗脱顺序：化合物极性越大，越先出柱； 化合物极性越小，越后出柱。 （5）反相分配色谱常用支持剂改性硅胶,亲油性表面,亲水性表面,硅胶,化学修饰,（ ）,3加压液相柱色谱法 （1）依据压力大小分类： A、快速柱色谱（约2.02105Pa） B、Lobar低压柱色谱（20.2105Pa） （2）固定相：RP-2、RP-8或RP-18 （3）流动相：水/甲醇或水/乙腈体系,(4).洗脱顺序： 化合物极性越大，越先出柱； 化合物极性越小，越
10、后出柱。 (5).应用范围： 分离水溶性或极性较大的成分，如苷类、酚性化合物等。 （6）色谱用载体材料： Zorbax类全多孔硅胶微球。, 常见Zorbax系列HPLC填充柱型号 柱子名称 键合固定相组成 适用分离方式Zorbax ODS 十八烷基组，-C18H37 反相 Zorbax C8 辛基组，-C8H17 反相 Zorbax TMS 三甲基硅组，-Si(CH3)3 反相,（三）凝胶过滤色谱 （gel filtration chromatography） 1、原理：系利用分子筛原理分离物质的一种方法， 其中所用载体为葡聚糖凝胶等。,（ ）,2、出柱顺序： 按分子由大到小顺序先后流出并得到
11、分离。 3、常用洗脱溶剂： 碱性水溶液（0.1mol/L NH4OH）、 含盐水溶液（0.5mol/L NaCl等） 醇及含水醇，如甲醇、甲醇/水 其他溶剂：如含水丙酮，甲醇/氯仿等 4、凝胶的种类与性质, 葡聚糖凝胶 Sephadex G,交联葡聚糖结构, 由平均分子量一定的葡聚糖及交联剂 （如环氧氯丙烷）交联而成。 葡聚糖凝胶颗粒网孔大小取决于所用交联剂的数量及反应条件。 商品用葡聚糖凝胶是根据交联度大小分类，并以吸水量多少表示。 例如：SephadexG-25， G为凝胶，后附数字=吸水量10。,羟丙基葡聚糖凝胶Sephadex LH-20 Sephadex LH-20 为Sephade
12、x G-25 经羟丙基化处理后得到的产物（具醚键形式） -OH -OCH2CH2CH2OH Sephadex LH-20分子中-OH数量无改变，但碳原子所占比例却相对增加了； 不仅可以在水中应用，也可在极性有机溶剂或它们与水组成的混合溶剂中膨润使用。, Sephadex LH-20保留了Sephadex G-25原有的分子筛特性；在由极性与非极性溶剂组成的混合溶剂中常常起到反相分配色谱的作用； Sephadex LH-20可以反复再生使用。 5、应用范围 Sephadex G主要用于分离糖、蛋白、苷。 Sephadex LH-20多用于分离苷和苷元。,（四）离子交换色谱 1、离子交换法分离物质
13、的原理 利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离。 固定相为离子交换树脂，其分子结构中存在许多可以电离的活性中心。待分离组分中的离子会与这些活性中心发生离子交换，从而在,流动相与固定相之间形成分配。 固定相的固有离子与待分离组分中的离子 之间相互争夺固定相中的离子交换中心，并 随着流动相的运动而运动，最终实现分离。 2、离子交换树脂的性质 3、离子交换树脂的组成 由两部分构成：,（1）母核部分 由苯乙烯通过二乙烯苯交联 而成的大分子网状结构，网孔大小用交联度 （即加入的交联剂的百分比）来表示。 离子交换树脂的等级表 （2）离子交换基团 常见：磺酸基(-SO3-H+) 、-N+(CH3)3Cl-、 -COOH、-NH2、亚氨基等,离子交换树脂的等级,（ ）,4、离子交换树脂的分类 （1）阳离子交换树脂： 强酸性阳离子交换树脂（-SO3-H+） 弱酸性阳离子交换树脂（-COO-H+） （2）阴离子交换树脂 强碱性阴离子交换树脂（-N+(CH3)3Cl-） 弱碱性阴离子交换树脂 例如：-NH2、仲胺、叔胺基等,5、洗脱液 氨水、NaOH、乙醇、盐酸、碳酸纳、 氯化铵溶液等。 6、应用范围 主要用于分离可离子化的成分，如生物碱、 氨基酸、有机酸和糖的硼酸络合离子等。 不同电荷离子的分离； 相同电荷离子的分离。,（ ）,
