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1、HPLC法在国内外药典中的 应用与比较,山东省药品检验所化学药品科 王小兵,2019/4/22,山东省药品检验所,2,汇报的主要内容,一、简述 二、高效液相色谱仪 三、系统适用性 四、色谱条件的调整 五、HPLC的应用及方法开发,2019/4/22,山东省药品检验所,3,一、简述,中国药典2010年版二部共收载2271个品种，新增品种330个，修订品种1500个，涉及HPLC检测项目的品种有1291个，占总品种的57%，其中新增/修订926个。 HPLC法在整个药典品种的检验中占有重要地位。,2019/4/22,山东省药品检验所,4,High Performance Liquid Chroma
2、tography简称HPLC，开始应用于20世纪60年代后期，现已趋于成熟，广泛应用于医药、生化、天然产物主要组分分析，以及食品、化妆品分析，环境分析，农业分析，石油化工分析等。 优点：高压+高速+高效+高灵敏度,一、简述,2019/4/22,山东省药品检验所,5,CHP(2010)：中国药典2010年版 USP：United Stated Pharmacopoeia EP：European Pharmacopoeia JP：Japanese Pharmacopoeia,一、简述,2019/4/22,山东省药品检验所,6,定义,CHP(2010)附录V D：HPLC系采用高压输液泵将规定的流动
3、相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。 USP(32)：High-pressure liquid chromatography (HPLC), sometimes called high-performance liquid chromatography, is a separation technique based on a solid stationary phase and a liquid mobile phase. Separations are achieved by partition, adsorption, or ion-exchange process
4、es, depending upon the type of stationary phase used.,2019/4/22,山东省药品检验所,9,二、高效液相色谱仪,基本组成：,2019/4/22,山东省药品检验所,10,泵,泵的种类很多，目前应用最多的是柱塞往复泵（恒流泵）,2019/4/22,山东省药品检验所,11,进样器,2019/4/22,山东省药品检验所,12,色谱柱分离的核心,CHP(2010)附录： 1.正相：硅胶柱； 反相： C-18柱、C-8柱； 2.粒径：普通310m； 2m（亚-2m仅能用于UPLC）； 3.温度要求：以硅胶为载体的通常 40；不宜超过60 ； 4.p
5、H要求：28；,8，硅胶溶解,以5m最为常见,2019/4/22,山东省药品检验所,13,色谱柱技术发展很快，新填料新技术也不断涌现，给我们提供了更多的选择。 Gemini-NX C18柱：,色谱柱,Kinetex C18柱：通过核-壳颗粒技术，使颗粒减小到2.6m，而无需高压即可达到提高速度、分离度和灵敏度的效果。,2019/4/22,山东省药品检验所,14,色谱柱,Zorbax StableBond柱： 采用了较大的二异丁基(SB-C18)或二异丙基(SB-C8、SB-C3、SB-Phenyl、SB-CN、SB-Aq)侧链基团和空间位阻，避免了在低pH条件下的水解破坏，其pH1.08.0，
6、温度上限也可达到8090，甚至在100%水相中也有出色的表现。,2019/4/22,山东省药品检验所,15,色谱柱,Zorbax Extend C18柱： 采用独特的双配位C18-C18键合技术，使的在高pH条件下使用硅胶基色谱柱成为可能，在pH211.5的范围内是稳定的。,2019/4/22,山东省药品检验所,16,USP(32):,Stationary phases for modern, reverse-phase liquid chromatography typically consist of an organic phase chemically bound to silica
7、or other materials. 1. Particles：usually 3 to 10 m in diameter；may range up to 50 m or more for preparative columns. 2. Internal diameters：usually 2 to 5mm for analytical separation，lager for preparative chromatography. 3. Temperature: only rarely above 60 ； 4.根据填料不同，USP在Chromatographic reagents in
8、the Reagents, Indicators, and Solutions section列出了USP-NF所用到的不同类型的柱子，如下所示:,C-18,硅胶柱,C-8,NH2柱,阳离子交换柱 （SCX）,CN柱,苯基柱,阴离子交换柱 （SAX）,L57L67未列出,2019/4/22,山东省药品检验所,19,EP(6.0) 2.2.29：,大部分分离机制都是基于以化学键合硅胶作为固定相，极性溶剂作为流动相的色谱条件。而化学键合相的性质往往决定了色谱系统的分离性能。,2019/4/22,山东省药品检验所,20,particle size：310m internal diameters：pr
9、escribed in the monograph, eg: pH：silica based reversed-phase columns are considered to be stable in mobile phases having an apparent pH in the range 2.0 to 8.0. temperature: not be heated above 60 Special：,EP(6.0) 2.2.29：,2019/4/22,山东省药品检验所,21,EP,Mannitol Assay:,2019/4/22,山东省药品检验所,22,JP(XV)：,A colu
10、mn with a stationary phase chemically bound on the inside wall instead of the column packed with the packing material may be used.,2019/4/22,山东省药品检验所,23,检测器,CHP(2010): UV DAD FLD ECD ELSD RID MS,优点：灵敏度高、噪音低、线性范围宽、对流速和温度的波动不灵敏，适用于梯度洗脱及制备色谱。 缺点：只能检测有紫外吸收的物质，流动相的选择有一定限制，流动相的截止波长必须小于检测波长。 适用范围：大多数有紫外吸收的
11、化合物。,优点：通用型检测器，对各种物质有几乎相同的响应。 缺点：灵敏度相对较低，流动相必须是挥发性的，不能用非挥发性的缓冲盐及表面活性剂。 适用范围：适用于挥发性低于流动相的组分，主要用于糖类、高级脂肪酸、磷脂、维生素、氨基酸、甘油三酯、皂苷及甾体等等无紫外吸收或紫外末端吸收的化合物的检测。,优点：灵敏度高、选择性好，是微量组分和体内药物分析常用的检测器之一。 缺点：只适用于能够产生荧光的物质的检测，适用范围不如紫外检测器。影响因素较多。 适用范围：具有天然荧光的物质或通过荧光衍生化变成荧光衍生物后测定，主要用于氨基酸、多环芳烃、维生素、甾体化合物及酶等的检测。,优点：灵敏度很高，尤其适用于
12、痕量组分分析。 缺点：干扰比较多，对温度和流速的变化比较敏感。 适用范围：应用范围广，凡具氧化还原活性的或经衍生化后具氧化还原活性的物质。,优点：灵敏度高，选择性好，能同时给出组分的结构信息。 缺点：响应信号受离子化效率限制，仪器较为昂贵，流动相必须是挥发性的，不能用非挥发性的缓冲盐及表面活性剂。 适用范围：组分的结构鉴别，微量及痕量组分的分析，药物代谢分析等。,优点：通用型检测器，只要组分的折光率与流动相的折光率有足够的差别就能检测。 缺点：灵敏度低、受环境温度、流量及流动相组成等波动的影响大，一般不能用于梯度洗脱。 适用范围：RID为通用型检测器，适用于无紫外吸收化合物的分析，如糖类分析。
13、,2019/4/22,山东省药品检验所,24,USP and EP,2019/4/22,山东省药品检验所,25,流动相,2019/4/22,山东省药品检验所,26,系统适用性 System Suitability,2019/4/22,山东省药品检验所,27,定义,CHP(2010):色谱系统的适用性试验通常包括理论板数、分离度、重复性和拖尾因子四个参数，其中，分离度和重复性尤为重要。 ICH definition: System suitability testing is an integral part of many analytical procedures. The tests ar
14、e based on the concept that the equipment, electronics, analytical operations and samples to be analyzed constitute an integral system that can be evaluated as such.,2019/4/22,山东省药品检验所,28,Definition,EP (6.0): The system suitability tests represent an integral part of the method and are used to ensur
15、e adequate performance of the chromatographic system. The various components of the equipment employed must be qualified and be capable of achieving the precision required to conduct the test or assay. USP(32): System suitability tests are an integral part of gas and liquid chromatographic methods.
16、They are used to verify that the resolution and reproducibility of the chromatographic system are adequate for the analysis to be done.,2019/4/22,山东省药品检验所,29,Definition,USP(32): No sample analysis is acceptable unless the requirements of system suitablity have been met. Sample analyses obtained while the system fails requirements are unacceptable. System suitability must be demonstrated throughout the run by injection of an appropriate control preparation at appropri
