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1、大肠杆菌分泌表达系统的构建,王富强,周兴军,王彦芳,田雪虹,张 谦,贺秉坤(华北制药集团新药研究开发中心,石家庄050015),大肠杆菌表达系统用于外源蛋白表达已经取得了令人瞩目的成果,是基因工程多肽药物生产的基础。建立自己的高效表达系统将极大地促进我们的研究及开发工作。,外源蛋白在大肠杆菌胞内表达,具有产量高、操作简便的优点。但许多外源蛋白在大肠杆菌中不能正确折叠,而是形成无活性不可溶的包涵体1。为获得高活性的功能蛋白,需要变性复性等一系列复杂操作,增加了工作难度和生产成本。,如果外源基因在大肠杆菌中表达形成可溶性,正确折叠,具有生物活性的蛋白,并分泌到培养基中,将为下游的纯化工作带来极大便
2、利,有效提高生产效率。为此,我们构建了 大肠杆菌分泌表达载体,成功地将 蛋白分泌到培养基中。,1 材 料 1.1 质粒与菌株 18质粒购自.公司。质粒和克隆及表达宿主5和101由本中心保存。 1.2 工具酶及试剂 限制性内切酶、聚合酶、4连接酶购自公司。各种分子生物学试剂分别购自华美生物工程公司及北京天象人生物工程公司。所用 单抗购自公司。,2 方 法 2.1 寡核苷酸片段合成 根据文献报道2,设计一对引物,由上海 公司合成。 上游引物1: 5 3, 带下划线处为识别位点; 下游引物2: 5 3。,2.2 扩增以 质粒为模板,利用设计的引物扩增出 序列。条件为:941,581,721,共30个
3、循环。最后72延伸7。,2.3 分子克隆 质粒提取、酶切、片段回收、连接、转化等操作均按照等人的方法进行3。 2.4 序列测定采用双脱氧法测定。 2.5 重组蛋白的表达 分别转化大肠杆菌5和101,得到工程菌。工程菌的培养与表达参照文献4进行。,2.6 和免疫印迹分别按照文献3方法进行。培养液离心,上清经丙酮沉淀后上样电泳。另外,菌体重悬于用冰预冷的20%葡萄糖,20/ ,2 5/,8溶液中,冰浴10,13000离心, 沉淀用预冷的20/ 2 5/,8重悬,冰浴 10,13000离心,取上清电泳分析5。,2.7 重组蛋白活性测定 细胞活性测定采用60细胞株。采用公司的试剂盒,按说明书进行。,3
4、 实验结果 3.1 表达载体的构建 以质粒18为背景6,构建 融合表达载体。在该系统中,外源基因表达由启动子与金黄色葡萄球菌蛋白启动子双重控制,有利于外源蛋白的分泌。信号肽选用金黄色葡萄球菌蛋白的信号肽序列,可将外源基因的表达产物分泌到培养基中。另外在5端含有两段人,工合成的蛋白 结合区的序列(),这可以极大提高外源蛋白的可溶性,提高其分泌效率。因为表达产物为融合蛋白,为最终获得与天然蛋白结构一致的重组蛋白,我们在外源基因5端引入蛋白酶识别位点。,以质粒为模板,用方法扩增出人片段。产物两端分别加入了和酶切位点。产物经双酶切后,与以同样酶切过的18质粒连接,转化5宿主菌,挑选阳性克隆。经序列测定
5、分析,证实编码正确。得到大肠杆菌融合分泌表达质粒,定名为(图1,图2)。,3.2 的分泌表达 将质粒转化5宿主菌,在培养基中进行表达。过夜，培养液离心,取上清液300,丙酮沉淀后 ,考马斯亮蓝染色。以18/5培养液上清及5培养液为对照。结果表明,在34000附近,比对照多出一条带,和预期的融合蛋白的一致(图3)。,3.3 活性检测 为进一步验证表达情况,培养上清液与菌体渗透液()分别做及生物活性检测。结果表明,表达产物和 单克隆抗体有明显杂交信号。细胞测活的结果表明,该融合蛋白具有 生物活性。检测亦证明了其活性。分泌表达是成功的。,4 讨论 大肠杆菌被内膜和外膜隔开形成胞内、周质和胞外3部分。
6、在大肠杆菌中表达的外源重组蛋白也可定位于胞内、周质空间或胞外培养基。其中,蛋白质跨过细菌的内膜定位于周质空间以及穿过细菌外膜到达胞外都可称作分泌()。,利用大肠杆菌系统,在外源基因的端融合一段细菌蛋白的疏水信号肽,可将目的蛋白运送到周质空间。蛋白跨内膜后由细菌的信号肽酶将信号肽切除,获得具有天然一级结构(不含端多余的甲硫氨酸)的产物。,氧化性的周质间隙可以模拟真核细胞的内质网环境,便于新生肽链折叠成天然结构,从而获得具有完全生物学活性的重组蛋白。此外,周质间隙中蛋白水解酶与胞内相比少得多,使产物不易被降解,因而提高了重组蛋白的稳定性7。,和胞内表达相比,分泌表达的主要问题是表达量较低。在胞内表达中,常采用7、等强启动子,外源蛋白多以包涵体形式存在,表达水平可达菌体总蛋白的10%70%。而在分泌表达中,强启动子往往使重组蛋白也形成包涵体,影响分泌效果。因此,在分泌表达系统中常采用强度较弱的等启动子。,总之,分泌表达是一项经验性很强的工作,且不可预测,在所有因素都优化后,结果可能仍不能令人满意。目前达到工业化生产规模的很少。比较成功的例子是重组的分泌表达15,16。分泌表达技术进一步的发展还需依赖对细菌转运机制的深入研究。,参考文献1 ,. .,1982 215:687. 2 ,. . ,1986 319:415. 3 ,. ,2,1989,
