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1、多肽 IS4 溶液构象的进一步 NMR 研究涂光忠苗振伟张日清罗雪春蒋云赵南明摘要利用二维核磁共振技术对多肽 IS4 中除 Ser-1 外的所有残基质子进行了指认.积分 NOESY 谱中的相关峰可得到距离约束.二面角的约束来自偶合常数 3JNH .由慢交换质子可得到氢键的约束.在进行距离几何程序计算时利用这些约束可得到一组构象,用能量最优化程序优化后的结果表明,多肽 IS4 在 CF3CD2OH 中的构象为 -螺旋.关键词多肽 IS4,2DNMR,多肽构象,结构计算Further NMR Investigation and ConformationStudy of Polypeptide IS
2、4TU Guang-ZhongMIAO Zhen-Wei ZHANG Ri-QingLUO Xue-ChunJIANG YunZHAO Nan-MingBiomembrane & Biomembrane Engineering National Laboratory,Department of Biological Science & Biotechnology, Tsinghua University, Beijing, 100084；College of Chemistry and Molecular Engineering,Peking University,Beijing, 10087
3、1AbstractTwo-dimensional 1H NMR technique was used to determine the solution structure of IS4. The cross-peaks volumes in NOESY spectra were used to generate proton-proton distance constraints. These data, combined with hydrogen bond constraints and angle constraints, were used to obtain a set of 10
4、 structures by program DIANA. These structures were refined by unrestrained energy minimization using standard minimization program. The results indicated that the conformation of IS4 in CF3CD2OD is of -helix.KeywordsPolypeptide IS4, 2D NMR, Polypeptide conformation, Structure calculation多肽 IS4 是鼠脑钠
5、离子通道蛋白第 1 个结构域中 6 个保守性跨膜片断中的第 4 个片断,其序列为 Ser-Ala-Leu-Arg-Thr-Phe-Arg-Val-Leu-Arg-Ala-Leu-Lys-Thr-Ile-Ser-Val-Ile-Pro-Gly-Leu-Lys.该片断几乎每隔两个残基就有 1 个带正电荷的残基,与其它几个片断 1一样,具有高度保守性,故多肽 IS4 被认为在调节钠离子通道开关中起重要作用.有关多肽 IS4 的作用机理目前有两种假说模型：即构象互换模型及螺旋滑动模型 2,3.搞清多肽 IS4 在不同溶液中的构象对研究其作用机理十分重要.前文 4曾研究了这一片断在 DMSO 中的构象,
6、本文将进一步研究多肽IS4 在三氟乙醇中的构象.1 实验部分多肽 IS4 采用固相技术合成,经 HPLC 纯化和冰冻干燥后用于 2DNMR实验.将 5.3mg 样品溶于 0.5mLCF3CD2OH(含 10%H2O，ISOTEC 公司)中,样品浓度约 4.3mmol/L.2D1HNMR NOESY 谱(弛豫延迟 2s,混合时间 m=200,400,600ms)、TOCSY 谱( m=40ms)和 DQF-COSY 谱均在 Bruker AM-500 型超导核磁共振仪上获得.实验温度 27,谱宽5956.55Hz.NOESY 谱和 TOCSY 谱的采样时间 0.172s,256 条 t1维复数点
7、经充零和傅里叶变换后变为 1024 条实数点;DQF-COSY 谱采样0.688s,512 条 t1维复数点经充零和傅里叶变换后变为 2048 条实数点.所有数据均通过接口 INCA-TCPlink2.0 传送到 SGI 工作站(用 UXNMR 和TRIPOS 核磁应用软件处理谱图), 1HNMR 谱以 DSS 为内标.将拟重水交换的样品溶于 90%CF3CD2OD(北京化工厂)10%D 2O 中,每隔一定时间采集 TOCSY 谱.由 DQF-COSY 和 TOCSY 谱得到自旋系统指认.由 NOESY 谱得到序列指认 5.混合时间 400ms 的 NOESY 谱用于结构计算.IS4 结构计算
8、步骤为:(1)将 NOESY 谱相关峰的积分值转换成距离约束,然后由距离几何程序 DIANA6算出初始溶液构象；(2)第二轮 DIANA 计算时,加入二面角和氢键约束；(3)无距离约束的能量最小化优化.2 结果与讨论采用常规方法归属 1HNMR 谱 5.由 DQF-COSY 谱的 NH 与 C H 相关峰区(指纹区)可清楚地分辨出 20 个残基的 NH_C H 相关峰,其中 Gly-20有两个 NH_C H 相关峰,N 末端的 Ser-1 未出峰,Pro-19 残基无 NH,所以无 NH-C H 相关峰.由 TOCSY 谱中各残基的 C H 出发很容易识别每个残基的偶合系统.除 Arg-7 与
9、 Val-8、Val-17 与 Ile-18 的酰胺质子靠得太近,无法观察其相关峰外,由 NOESY 谱中的 NHi-NHi+1相关峰(图 1)可得到 Leu-3 至Arg-7、Val-8 至 Val-17、Gly-20 至 Lys-22 相邻残基间的序列连接,Arg-7 与 Val-8、Val-17 与 Ile-18 间的连接由其 C H-NH 相关峰完成；Pro-19 与 Gly-20 间的连接由 dN 完成；Ile-18 与 Pro-19 的连接由Ile-18 的 -H 与 Pro-19 的 -H(Pro 残基的 质子可以起到 NH 的作用 7)的相关来完成.除 Ser-1 外,所有残基
10、质子的归属列于表 1.Fig.1The NH-NH region of 500MHz phase-sensitive NOESY spectrum of IS4 in CF3CD2OH with 10% water(T=300K; m=400ms)with connectivities traced between cross peaksTable 1 1H NMR chemical shifts of IS4 in CF3CD2OH at 300K*ChemicalshiftsResidueNH C H C H OtherprotonsSer-1 Ala-2 8.67 4.25 1.46 L
11、eu-3 7.66 4.20 1.73 C H1.70；C H0.90,0.97Arg-4 7.58 4.08 1.98 C H1.73；C H3.25；N H7.20Thr-5 7.69 3.90 4.18 C H1.21Phe-6 8.11 4.36 3.25 2,6-H7.24；3,5-H7.31；4-H7.20Arg-7 8.02 3.98 2.08,2.00 C H1.73；C H3.23；N H7.17Val-8 8.01 3.71 2.25 C H0.98,1.09Leu-9 8.30 4.09 1.88,1.54 C H1.88；C H0.90Arg-10 8.13 3.94
12、1.85,1.90C H1.59；C H3.12,3.08；N H7.08Ala-11 7.96 4.13 1.60 Leu-12 8.60 4.11 1.94,1.53 C 1.92；C H0.89,0.86Lys-13 8.43 4.04 1.97 C H1.59；C H1.71；C H2.95Thr-14 7.91 4.01 4.46 C H1.27Ile-15 8.16 4.00 2.01 C1 H1.68,1.33；C 2 H0.98；C H0.88Ser-16 7.77 4.33 Val-17 7.49 4.25 2.29 C H1.05,0.99Ile-18 7.58 4.30
13、C1 H1.73,1.28；C 2 H0.98；C H0.91Pro-19 4.37 2.28,1.94 C H2.11,2.00；C H4.01,3.67Gly-20 7.804.02,3.88 Leu-21 7.65 4.37 1.72,1.65 C H1.71；C H0.94,0.89Lys-22 7.77 4.33 1.89,1.80 C H1.48；C H1.71；C H3.02*Chemical shifts were referred to DSS. 由表 1 可归属 NOESY 谱中的每个相关峰.由图 2 示出的 NOESY 谱中残基间的 NOE 可见,存在很强的 NHi-NH
14、i+1峰,并有许多 i-NHi+3及一定数量的 i-NHi+4和 i- i+3,表明存在 -螺旋 7.从偶合常数看,残基Leu-3 至 Ile-15 的 3JNH 偶合常数均小于 6Hz,符合 -螺旋的特征 8.为确定慢交换氢,称取约相同重量的 IS4 溶于 0.5mL90%CF3CD2OD+10%D2O 中,每隔一定的时间测其 TOCSY 谱,13h 后还可从 TOCSY 谱中找到残基 Arg-7至 Ile-15 的酰胺质子(图 2),表明慢交换氢可能参与了 -螺旋内氢键的形成 9.Fig.2 Summary of the sequential NOE connectivities, and
15、 slowly exchanging backbone NH proton observed in IS4The chemical shift index is indicated by a ternary index with values of -1, 0 and +1. The height of the bars indicates the intensities of the NOEs between the two residues化学位移指数(CSI) 10,11是表征二级结构与氨基酸残基 C H 的化学位移间对应关系的重要参数.与无规卷曲时的化学位移相比,-螺旋中残基 C H
16、的化学位移一般向高场偏移 0.1,而 -折叠中残基 C H 的化学位移则向低场偏移 0.1,Wishart 10将每个残基 C H 的化学位移分别用-1,0 和+1 表示,即为该残基的化学位移指数(Chemical Shift Index,CSI),其中+1 和-1 分别表示 C H 化学位移与无规卷曲时 C H 化学位移相比向高场和向低场的偏移大于 0.1,而偏移在0.1 间时用 0 表示.任何连续 4 个或 4 个以上的-1(两个-1 之间允许被一个 0 打断)被认为在该处为 -螺旋结构;当出现 3 个或 3 个以上连续的+1 时,被认为在该处为 -折叠.该方法与传统的基于 NOE 确定二级结构的方法有相同的精度.图 2 中给出了
