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1、多糖类物质的研究进展李自明 11 级食品科学与工程 111304023摘要 多糖是由 10 个以上单糖通过糖苷键连接而成的聚糖，在自然界中分布极广，在高等植物、藻类、菌类及动物体内均有存在，是自然界含量最丰富的生物聚合物。人们对多糖的认识首先是把它看作食物中的能量来源。多糖作为药物始于 1943 年，但从 20 世纪 60 年代以来，人们逐渐发现多糖在抗肿瘤、肝炎、心血管疾病、衰老等方面有独特的生物活性，且细胞毒性极低。近年来，由于天然药物化学、药理学研究的不断深入，多糖分析手段得到突飞猛进的发展。研究发现，多糖可作为生命活动中核心作用的遗传物质，它能控制细胞分裂和分化，调节细胞的生长与衰老等
2、多种复杂的功能。本文将对多糖的提取、分离纯化、组分分析以及生物活性等研究内容做一综述。关键词 多糖;分离纯化;结构分析;生物活性1 多糖的研究概况多糖是除了蛋白质和核酸以外的一类重要的生物大分子, 虽然糖类的研究并不比蛋白质和核酸晚, 但其研究层次与水平还远远落后于蛋白质和核酸。20 世纪 70 年代以来,随着免疫物质、 生物膜及多种生物活性物质的研究表明, 糖类在生物体内具有各种关键的生物学功能, 因此糖类的研究成为人们关注的焦点。大量的药理实验表明,多糖类化合物具有免疫增强与调节、 抗肿瘤、 抗病毒、 抗凝血、 抗放射、 抗衰老等作用。日本自 20 世纪 80 年代以来, 已有数种多糖应用
3、于临床。近年来,日本及欧美学者引进现代分子生物学技术手段,加强对中药多糖活性决定簇等化学结构与功能关系的研究,并在柴胡、 当归等中药的研究方面有了一定的突破。国内的研究起步较晚, 虽然已在云芝糖肽、 银耳多糖等的研究中取得了一定的进展,但对药用多糖的研究仍多偏重于提取、 分离、 精制、 化学组成等方面, 大多数品种尚处于实验阶段或仅用于滋补品和饮料,与国外相比仍有一定的差距。2 多糖的分离纯化与性质研究2.1 多糖的提取分离与纯化多糖是极性大分子化合物，大多采用不同温度的水、稀碱或稀盐溶液提取，尽量避免在酸性条件下提取，以防引起糖苷键的断裂。稀酸提取时，时间宜短，温度不宜超过 50。由于水提时
4、间长且效率低，酸碱提取易破坏多糖的立体结构及活性。现有采用复合酶热水浸提相结合的方法提取多糖，复合酶多采用一定比例的果胶酶、纤维素酶及中性蛋白酶。此法具有条件温和、杂质易除和得率高的优点。多糖提取之后，其中还含有许多杂质要除去。一般首先利用多糖难溶于有机溶剂的特性，用乙醇或丙酮进行反复沉淀洗涤，除去一部分醇溶性杂质，然后用Sevag 等法脱游离蛋白质。用蛋白酶去除结合蛋白质，小分子杂质的除去可以用透析法。至此，得到的溶液基本上是没有蛋白质与小分子杂质的多糖混合物。分级（即将多糖混合物分离为单一的多糖）的方法很多，主要有以下一些方法：分部沉淀法、盐析法、金属络合法、季铵盐沉淀法、纤维柱层析法、纤
5、维素阴离子交换柱层析法、凝胶柱层析法、超滤法、制备性区域电泳法和制备性高压液相色谱法等，但大多数采用 DEAE纤维素、DEAE、凝胶及其它凝胶柱层析法进行纯化，国外常采用 LKB 柱层析系统。2.2 多糖纯度的鉴定多糖的纯度不能用通常化合物的纯度标准来衡量，因为即使是多糖纯品，其微观也是不均一的。多糖的纯度只代表相似链长的平均分布。我们通常所说的多糖纯品实质上是一定分子量范围的均一组分。目前各国常用的纯度鉴定方法有：超离心、高压电泳、凝胶层析和旋光测定。现在应用较多的是 HPLC 法。通常要肯定某一多糖的均一性，必须要有两种方法以上的鉴定结果。2.3 多糖分子量的测定多糖的分子量测定至今仍是一
6、个复杂的问题。现在还没有一种准确的测定方法。多糖的分子量只代表一定相似链长的平均配布。往往用不同的方法会测得不同的分子量，即使是同一多糖其重均分子量也会与数均分子量相差很大。目前常用的测定分子量的方法很多，如渗透法、超离心法、超过滤法、高压电泳法、粘度法、光散射法、还原末端法及聚合度法等，这些方法比较麻烦且误差较大。耐压合成凝胶的出现使得高效液相色谱法广泛应用于多糖的纯度和分子量的测定。它具有快速、高分辨率和重现性好等优点。而在实验室中最常用的方法是凝胶过滤法。3 多糖的生物活性3.1 对免疫系统作用3.1.1 多糖对巨噬细胞功能的影响在机体的免疫系统中，巨噬细胞由于其活跃的生物学功能尤其是在
7、免疫应答和机体防御机制中的重要作用而一直受到重视。巨噬细胞能表达数十种受体，产生数十种酶，并能分泌近百种生物活性产物，是体内功能最为活跃的细胞之一。巨噬细胞具有吞噬功能，能主动吞噬和清除颗粒性外来抗原或直接杀伤病原微生物；还能通过其产生的肿瘤坏死因子(TNF)及 NO 等分子杀伤靶细胞，同时产生多种生物活性物质，发挥其免疫调节作用。Ramesh H 等3研究了胡芦巴半乳糖配甘露聚糖对大鼠腹腔巨噬细胞的吞噬活性、人淋巴细胞 HB4C5 增殖和免疫球蛋白 M 分泌的活化作用。多糖碱提取部分 B 在 10g/ml 浓度下对大鼠腹腔巨噬细胞表现出 40%的活化作用。对于 HB4C5 淋巴细胞，碱提取的
8、多糖 B 能提高其活化百分率，对 IgM 分泌的影响在 2.5g/ml 浓度下表现为 24%的抑制作用。Bianco ID 等从真菌细胞壁中发现的一种壳聚糖，能以剂量、时间依赖方式通过增强花生四烯酸的活性来激活巨噬细胞4。现研究发现从Panax quinquefolius L.根茎中提取的多糖具有刺激肺巨噬细胞分泌 TNF的作用5。3.1.2 多糖对淋巴细胞功能的影响淋巴细胞是构成免疫器官的基本单位，在免疫应答过程中起核心作用。淋巴细胞分为 T、B、NK、K、LAK 细胞等6。T 细胞在机体的细胞免疫和体液免疫诱导中均有重要作用，作为免疫效应细胞，主要有两方面功能：即作为 TDTH 介导迟发型
9、超敏反应和作为 T 细胞直接杀伤靶细胞。B 细胞通过其分泌的抗体行使其免疫功能。另外活化的 B 细胞还具有加工和提呈抗原给 T 细胞的作用。NK细胞即自然杀伤细胞，它既不需经抗原刺激，也不需要抗体参与，即能杀伤某些靶细胞。同时 NK 细胞也是一类重要的免疫调节细胞，它对 T 细胞、B 细胞、骨髓干细胞等均有调节作用，并通过释放细胞因子对机体免疫功能进行调节。从多叶奇果菌 C (rifolafrondosa)分离得到的多糖 D 一片段，能激活肿瘤患者体内的 NK 细胞，使 TNF 和干扰素(IFN)水平升高，同时还可通过激活巨噬细胞，使 IL12 分泌增加，后者也是 NK 细胞的激活剂，可使 N
10、K 细胞长期发挥细胞毒作用，抑制肿瘤细胞的生长1。Park JI 等用热水和碱水从一种韩国药用植物黄柏的皮层中提取、分离纯化得到一种杂多糖，表现出有效的 B 淋巴细胞刺激活性2。3.1.3 多糖对抗体生成的影响抗体与抗原特异结合，可直接中和具有毒性的抗原分子；抗体结合抗原后形成的复合物易被吞噬细胞吞噬清除；抗体又可与抗原结合后，再结合补体，使补体活化，杀伤病原体。Han SB 等报道，从 Platycodon grandiflorum (PG)根中分离的一种多糖能够显著地增加 IgM 的产生，促进 B 细胞增殖，刺激巨噬细胞内一氧化氮合酶(iNOS)的转录和产生7。Nergard CS 等发现
11、 Vernonia kotschyana 的根茎可以治疗胃炎、十二指肠溃疡，而从其根茎中提取的多糖具有促进 B 细胞增殖、激活 T 细胞的作用8。3.1.4 多糖对细胞因子分泌的影响细胞因子是由活化的免疫细胞和某些基质细胞分泌的一类小分子糖蛋白，具有多样生物学作用，包括促进靶细胞增殖分化、增强对感染的抵抗力、参与调节机体的免疫应答和炎症反应、影响细胞代谢等。从 Phellinus linteus 中提取的 PL 多糖，通过产生 NO 和 TNF 抵抗 Yac1 细胞的毒性作用，而起到免疫调节和抗肿瘤作用9。AnastaseRavion S 等在研究天然硫酸化多糖的免疫调节特性时发现，葡聚糖衍生
12、物和褐海藻能影响 LPS，刺激 M 引起的致炎细胞因子释放10。3.2 多糖的抗肿瘤作用多糖溶于水是其发挥生物活性的前提。作为药物多糖的研究已给肿瘤的化疗开辟了新的领域。Wang JC 等研究发现，通过调整 C/N 比例、pH 值、温度，从Pleurotus citrinopileatus 中提取的主要由葡萄糖和甘露糖组成的可溶性多糖 SPPC，可以显著增加肺转移性肿瘤小鼠体内 T 细胞、CD4(+)细胞、CD8(+)细胞和巨噬细胞数量,抑制肿瘤细胞的增殖11。从枸杞中提取的多糖蛋白质复合体 LBP3p 能作用 S180 肉瘤小鼠的免疫系统，表现为增强巨噬细胞的吞噬活性，促进淋巴细胞增生，增强
13、细胞毒性 T 细胞活性，增加 IL2 mRNA 的表达，同时减少 S180 小鼠脂质过氧化12。Ji YB 等研究发现，S180 小鼠与正常小鼠比较，其红细胞膜上带 3 蛋白含量呈明显下降趋势，而且出现交联蛋白，小鼠红细胞微粘度升高，膜脂流动性下降。而药用和食用仙人掌多糖都可提高荷瘤小鼠红细胞膜带 3 蛋白的含量，降低交联蛋白的形成，改善膜脂流动性，降低荷瘤小鼠红细胞膜的微粘度，从而部分恢复、提高红细胞膜结构的完整性与生理功能的正常性，增强红细胞免疫功能，这可能是仙人掌多糖抗肿瘤作用的机制之一13。从韩国红人参中提取的红人参酸多糖(RGAP)，通过刺激巨噬细胞产生 NO调节免疫和抗肿瘤。研究发
14、现，RGAP 和紫杉醇在小鼠 S180 肉瘤和 B16 黑色素瘤的联合治疗中可起协同作用。RGAP 可呈浓度依赖性的刺激脾细胞分泌IL6，同时拮抗紫杉醇对 NK 细胞活性的抑制作用14。Liu JJ 等研究发现，从樟脑菌丝中分离纯化的多糖 ACPS，通过激活单核细胞而抑制人白血病 U937细胞的增殖，抑制率约达 55.3%15。3.3 多糖的抗炎作用抗炎活性的多糖在国外研究较多的是细菌荚膜多糖，其中脆弱类杆菌(Bacteroides fragilis)荚膜多糖的抗感染活性研究的较为深入16。脆弱类杆菌的荚膜多糖分为两种组分：Ps A 和 Ps B。这些荚膜多糖居于细菌表面，形成脆弱类杆菌的所谓
15、荚膜多糖复合物(capsular polysaccharide complex,CPC)，具有显著的生物活性。其中 Ps A 活性较强，在体外具有 T 细胞增殖活性17，在体内具有抗脓肿形成作用18。来源于真菌细胞壁的 (13)葡聚糖也具有抗炎作用。服用可溶性 (13)葡聚糖，能够显著增加动物体内参与循环的中性粒细胞数量，还可提高单核细胞和中性粒细胞抗微生物的活力，增强巨噬细胞的功能，并刺激骨髓造血19。服用 PGG葡聚糖一种高度纯化的具有(16)分支的葡聚糖的动物进行血培养，和对照组相比，可检出较少的微生物数量。一次性注射 PGG 葡聚糖的小鼠或大鼠，其白细胞总数出现一过性升高，即使在感染后
16、 4 h 服用 PGG 葡聚糖也能显著地降低死亡率20。来自一种菌丝体的胞外多糖(exopolysaccharides,EPSs)，也具有抗炎活性，腹腔注射能够显著提高小鼠对产单核李斯特菌感染的抵抗力，在体内能够诱导淋巴细胞的增殖21。当发生急性炎症时，炎症因子与抗炎症因子间存在着平衡关系，影响着炎症发生的进程。当机体感染细菌后，多种炎症介质迅速释放，包括TNF 、IL1 、IL6 和 IL8 ；数小时后，抗炎症因子如 IL10 、MCP1产生，以对抗炎症反应。此外，这些细胞因子能够直接抑制炎症因子的生成或促进特定细胞因子抑制剂的合成，如 IL1 受体和可溶性 TNF 受体；也可下调趋化因子及其受体和 Th1 细胞因子的水平。抗炎的机制一般认为是促进免疫细胞的活性，下调炎症因子如 TNF 、IL1 、IL6 和 IL8 ，上调抗炎症因子
