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1、临床医学论文-rsistin 基因的克隆及载体的构建【摘要】 目的：克隆小鼠 resistin 基因及其连载体的构建，为进一步研究resistin 的功能打下基础。方法：根据报道的小鼠 resistin 基因的全长 mRNA序列为目的基因，即提取小鼠脂肪组织中的 RNA，以 RNA 为模板，在逆转录酶的作用下，逆转录（RT）合成 resistinDNA，再在 TaqDNA 聚合酶的作用下聚合酶链反应（PCR）扩增 resistin cDNA，将扩增 PCR 产物（resistin cDNA）经纯化后与 AT 连接于 pGEMT 载体，重组质粒转化 JM 109 感受态菌，蓝白斑筛选阳性菌落，摇
2、菌、提取质粒。结果：提取的总 RNA 纯度 A260/280 为 1.9,电泳条带 28 s18 s 比例约为 21,RTPCR 与欲扩增的目的片段的理论长度363 bp 相符,重组质粒插入 pGEMT 的 DNA 片段的核苷酸序列与小鼠 resistin基因 mRNA 编码区序列完全一致。结论：成功克隆了小鼠 resistin cDNA 基因，为构建 resistin 基因打下基础。 【关键词】 小鼠 resistin 基因；载体；构建resisin 又称抵抗素，可损害糖代谢，影响组织对胰岛素的敏感性1，被认为可能是联系肥胖与型糖尿病的重要纽带2,3。小鼠 resistin 基因mRNA 全
3、长 519 个碱基,编码区(cds)是由 84 位至 428 位共 345 个碱基组成,编码114 个氨基酸残基组成的 resistin 蛋白质。目前对 resistin 的生物功能了解甚少，为了探讨 resistin 的功能，本研究拟用 RTPGR 技术从小鼠脂肪组织中扩增 resistin cDNA，A/T 克隆于 pGEMT 载体。为进一步研究 resistin 功能及与糖尿病的关系奠定实验基础。1 材料与方法1.1 主要试剂 TRIol Reagent 总 RNA 提取和 THERMOSCRIPTTM RTPCR System（购自 GIBCOL BRL 公司），PCG 引物（由 Ta
4、kaRa Biotech 公司合成）Qiaquick Gel Extraction Kit、Plasmid Qiaprep Spin Miinprep Kit 和Endofree Plasmid Maxi Kit（购自 QIAGEN 公司），pGEMT vector systemI（购自 promega 公司），限制性内切酶 XbaI、EcoRI 和 NotI(购自 ENB或 MBI Fermenta 或 Rroche 公司),T4DNA 连接酶(购自 Takara Biotech 公司)，JM 109 大肠杆菌由本院医学研究中心提供。1.2 方法1.2.1 总 RNA 测定 提取总 RNA：
5、取正常雄性 BALB/C 小鼠，16 周龄，体重 38 g（购自中山大学动物实验中心）。取其脂肪 200 mg，按照一步法提取总RNA。检测总 RNA：电泳检测总 RNA 质量；紫外分光光度法检测总 RNA 纯度和含量。RNA 浓度计算：RNA=A26040稀释倍数。1.2.2 逆转录合成 cDNA 按 Mmnlv RTPCR 试剂盒说明书操作逆转录合成 cDNA。1.2.3 PCR 扩增 resistin cDNA PCR 引物设计,根据小鼠 resistin 基因mRNA 序列,用计算机软件设计引物,并在上、下游引物的 5端分别引入 Eco R1和 Xba酶切位点。上游引物：5CGGAAT
6、TCATGAACCTTTCATTTCC3 （下划线的部分为 Eco R1 酶切位点）；下游引物：5CTAGTCTAGATCAGGAAGCGACCTGCAGCT3 （下划线的部分为 Xba酶切位点）；扩增 resistin 基因全长编码区序列,扩增片段理论长度为 363 bp。在一个 50 l 的反应体系中进行 PCR，并对反应体系中 RT 产物、引物和 MgCl2 的量及热循环参数进行了数次优化，共同进行了 35 循环。2%的琼脂糖凝胶电泳成像。1.2.4 凝胶回收纯化 PCR 产物 按 Qiaquick Gel Extraction Kit 操作说明，凝胶电泳观察回收结果,紫外分光光度法检测
7、 DNA 含量及纯度检测。1.2.5 受体感受态 JM109 菌的制备 用 CaCl2 法(0.1 M 的进口 CaCl2)制备感受态细胞。1.2.6 纯化 PCR 产物 AT 连接于 pGEMT 载体 按插入片段与载体的摩尔比为 31 的量进行连接反应,总反应体系 10 l,置 4 冰箱过夜连接。1.2.7 连接反应液转化 JM 109 感受态菌液 连接 DNA 反应液 10 l,加入 200 l 受体感受态菌液中，最后行蓝白斑筛选，挑选单个白色菌落，加入2 l LB 液体培养基中（含氨苄青霉素），37 震荡增殖转化菌。1.2.8 提取重组质粒 PGEMTreisitin 上述菌液扩增至生长
8、晚期，按Qiaprep Spin Miniprep Kit 操作说明提取质粒。凝胶电泳提取的重组质粒的质量和紫外分光光度法检测 DNA 含量及纯度检测。1.2.9 鉴定和保存重组质粒 pGEMTreisitin 重组质粒pGEMTreisitin ：双酶切鉴定(内切酶购自 NEB 公司)，反应体系如下:pGEMTreisitin(0.35 g/l)5 l、EcoRI1 l、Xba1 l、10NEBuffer 2 l、10BSA 0.2 l 加三蒸水至 20 l，37 水浴2 hr 紫外灯下观察结果；核苷酸序列分析鉴定：重组 T 载体送 TakaRa Biotech公司测序。2 结果2.1 判断
9、总 RNA 的质量和浓度 提取的小鼠脂肪组织总 RNA，经凝胶电泳后，紫外灯下呈现清淅的 28 s、18 s、HE 5 s 三条带，且 28 s 与 18 s 条带丰度比约为 21，说明总 RNA 无降解。A260/280 为 1.9,表明总 RNA 纯度高，总RNA 浓度为 0.5 g/l,总量 15 g。2.2 RTPCR 产物电泳分析 RTPCR 产物凝胶电泳后，紫外灯下可见一清晰的条带位于 250 bp 与 500 bp，与欲扩增的目的片段的理论长度 363 bp 相符。2.3 重组质粒 pGEMTreisitin 酶切鉴定 重组质粒被 EcoR和 Xba内切酶切为两条带，片段的大小与
10、理论值 pGEMT3000 bp 和插入的目的片段363 bp 相符。2.4 重组质粒 pGEMTreisitin 核苷酸序列分析 pGEMTreisitin核苷酸序列分析酶切位点图表明 PCR 产物已连于 pGEMT 载体，插入 pGEMT的 DNA 片段的核苷酸序列顺向测序和反向测序均证明插入的 DNA 片段与小鼠reisitin 基因 mRNA 编码区序列完全一致。3 讨论据报道 reisitin 基因仅在白色脂肪（WAT）中大量表达，且小鼠成年后较出生时 reisitin mRNA 表达增高。小鼠 6 周9 周性发育成熟，即进入成年期。本研究挑选 16 周的成年雄性小鼠，取其附睾周围及
11、网膜的 WAT 用于提取总RNA，以使被取的脂肪组织 reisitin 表达丰度高，有利于通过 RTPFR 扩增reisitin cDNA。RTPCR 产物凝胶电泳鉴定，扩增出一特异性条带，大小在250 bp 与 500 bp 之间，与目的片段的理论长度 363 bp 相符。推测它是欲扩增的 reisitin cDNA。由于 PCR 产物直接进行双酶切，难以判断酶切成功与否，盲目接着进行下一步连接反应，易造成时间和试剂的浪费。因此，本研究选用T 载体作为过渡。因 Taq 聚合酶具有在 PCE 产物 3 端加 A 碱基的功能，T 载体是人工改良的两头 3 末端加有 T 碱基开环的质粒，PCR 产
12、物与 T 载体经 T4DNA 连接酶 AT 连接，可大大提高带有 Lacz 基因，可行蓝白斑筛选转化阳性菌落。GEMT 质粒是专门用于“A/T 克隆”高考贝数的 T 载体，达到 3 000 bp，其带有 1 个氨苄青霉素抗性基因用于筛选，有多克隆酶切位点，使插入的 DNA 片段可通过内切酶再取出。多克隆酶切位点两侧分别带有 T7 和 SP 两个反向的噬菌体的启动子，这种构架允许外源 DNA 的任一条链在体外得到转录。本研究重组质粒 pGEMTreisitin 进行双酶切后，凝胶电泳，紫外灯下可见重组质粒被切为 3 000 bp 和 363 bp 的两条带，表明 RTPCR 产物已连于 pGEM
13、T 载体。重组 pCEMT 质粒的核苷酸序列分析显示，插入 pGEMT 的 DNA 片段的核苷酸序列与报道的小鼠 resistin 基因编码区序完全一致，表明 resistin 基因 cDNA克隆成功。这为构建 resistin 基因提供了物质基础。【参考文献】1 Strppan CM，Brown EJ，Wright CM，et al.A family of tissuespecific Resistinlike moleculesJ.P Natl Acad USA,2001,98（2）：502506.2 Senior K.Resistin links obesity to typediabetesJ.Lancet,2001,357:202.3 Steppan CM，bailey ST，Bhat S，et al.he homone resistin linds obesity to diabetesJ.Nature，2001,409:307312.
