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1、ZHENG Ya-jie, ZHANG Rui-ping, GAO Yang, WANG Yu-cheng, WANG Ju-xian, HE Jiu-ming, ABLIZ Zeper. Impurity analysis and quality evaluation for commercial levofloxacin formulations using LC-MS/MS methodJ. Acta Pharm Sin, 2016, 51(3): 444-449. 郑亚杰, 张瑞萍, 高杨, 王玉成, 王菊仙, 贺玖明, 再帕尔阿不力孜. 左氧氟沙星中杂质的 LC-MS/MS 定量分析
2、方法及其市售制剂的质量评价研究J. 药学学报, 2016, 51(3): 444-449. 左氧氟沙星中杂质的 LC-MS/MS 定量分析方法及其市售制剂的质量评价研究 郑亚杰 1,2, 张瑞萍 1, 高杨 1, 王玉成 3, 王菊仙 3, 贺玖明 1 , 再帕尔阿不力孜 1 摘要: 建立了左氧氟沙星制剂中微量杂质的 LC-MS/MS 定量及筛查方法,方法学考察表明该方法快速、灵敏度高和专属性强。利用该方法对 19 个厂家市售左氧氟沙星药物制剂中的杂质进行检测和质量评价。上述样品中超过杂质限度的杂质共检出 5 种,且不同厂家制剂中的杂质含量差异较大,仅 3 个厂家制剂中杂质的含量均低于 0.0
3、1%。左氧氟沙星的 N4-甲基季铵类杂质在左氧氟沙星制剂中首次检出。结合杂质来源,认为左氧氟沙星药物制剂中杂质水平的差异与原料药、制剂工艺参数的控制及运输储藏的环境有着密切关系。该方法能专属、灵敏和全面地检测药物制剂中的杂质,为客观评价制剂质量及质量控制提供了高效的分析手段,所检出杂质种类及含量水平能客观地反映左氧氟沙星制剂的质量。 关键词: 左氧氟沙星 杂质 液质联用 制剂 质量评价 Impurity analysis and quality evaluation for commercial levofloxacin formulations using LC-MS/MS method Z
4、HENG Ya-jie1,2, ZHANG Rui-ping1, GAO Yang1, WANG Yu-cheng3, WANG Ju-xian3, HE Jiu-ming1, ABLIZ Zeper1 Abstract: The study aims to develop a rapid, specific and sensitive method for quantitative analysis of trace impurities in levofloxacin formulation using LC-MS/MS. The quality of the different form
5、ulations from 19 plants was evaluated in the contents of the impurities. The results indicated that there were 5 impurities in the samples, and the content was different in the products with same formulation by different plants. The products of 3 plants were in good quality with impurities level und
6、er 0.01%. Levofloxacin N4-methyl quaternary impurity was first reported as the formulation impurity. The impurities were tightly correlated to the reservation of drug, process control of formulation and storage during transportation. The results suggest that our method is sensitive and specific to d
7、etect the trace impurities in formulation, and can be used to monitor the quality of commercial drug product. Key words: levofloxacin impurity LC-MS/MS formulation quality evaluation 左氧氟沙星是以 4-喹诺酮为母核的人工合成抗菌素,因其具有抗菌谱广、抗菌效率高和体内生物利用度好等特点,已成为临床上广泛使用的抗菌类药物之一 1,2。据 20112013 年国家药品不良反应监测年度报告,喹诺酮类药物的严重不良反应报告
8、数量居抗感染药物不良反应/事件的前三位,左氧氟沙星药物的不良反应报道居该类药物的首位。药物不良反应除药物自身理化性质外,与药物中的杂质也有密切关系 1,3。根据 ICH 指导原则,对于原料药和制剂中存在的工艺相关杂质 (impurity,IMP) 和降解产物 (degradation product,DP),尤其是超过鉴定阈值或随着时间呈增加趋势的杂质必须进行杂质结构研究,并建立杂质的定量分析方法,为杂质的限度控制和药物的质量控制提供必要的数据支持 4。 基于 LC-MS/MS 技术的多反应离子监测 (multiple reaction monitoring,MRM) 方法具有灵敏、准确和选择
9、性强等特点,能够有效地排除干扰离子,因此被广泛用于复杂样品体系中微量成分的定量分析 5, 6, 7, 8。本课题组前期开展了基于 LC-MS/MS 技术的左氧氟沙星原料药中微量杂质的定性分析方法研究,利用该方法结合强制破坏实验对药物原料药中可能产生的杂质结构及其来源进行了阐明,鉴定出 20 个左氧氟沙星相关的杂质 9。由于实验室的强制破坏条件并不完全代表原料药和制剂生产、存储和流通等环节中实际的化学或环境影响因素,因此有必要对市售左氧氟沙星药物制剂中的杂质进行分析检测,了解杂质在制剂中的实际存在状况。 本研究开展了基于 LC-MS/MS 技术的药物制剂中杂质的定量分析与筛查方法研究,针对市售左
10、氧氟沙星药物制剂中的杂质进行全面、准确、快速地检测,完成不同厂家的市售药物制剂中杂质的筛查检测,并对其质量进行初步评价,为左氧氟沙星药物制剂的质量控制及安全性评价提供参考。 材料与方法仪器与试药 Agilent 1200 Series 快速高效液相色谱仪 (安捷伦公司,美国); QTRAPTM 四极杆-线性离子阱串联质谱仪 (QTRAP 5500,美国 AB Sciex 公司),配备 Turbo Ion spray (ESI) 离子源以及 Analyst 1.5.1 数据采集和处理系统; 分析天平 (METTLER TOLEDO AG135 型,梅特勒-托利多仪器有限公司); Eppendor
11、f 微量移液器和移液管。左氧氟沙星对照品 及氧氟沙星杂质 A 对照品均购自中国食品药品检定研究院; descarboxyl levofloxacin,desmethyl levofloxacin hydrochloride 和 N,N-desethylene levofloxacin hydro-chloride,购自加拿大 TRC (Toronto Research Chemicals Inc.) 公司。左氧氟沙星季铵盐由中国医学科学院医药生物技术研究所王玉成研究员课题组提供。左氧氟沙星片剂、胶囊和滴眼液等均为市售药品; 甲醇和甲酸 (色谱纯) 购自 Merck 公司; 实验用水为娃哈哈纯净
12、水。 对照品溶液的配制分别精密称取上述各对照品适量,加甲醇超声溶解并定容,得到质量浓度约为 0.5 mgL-1 的溶液,作为储备液。吸取上述储备液各适量体积,混匀配制成所需浓度的混合标准品溶液。 样品预处理取片剂样品各 10 片,分别研细,备用; 取胶囊样品各 10 粒,取内容物,分别混匀,备用; 液体制剂样品直接取样不需经预处理。 供试品溶液的配制取上述预处理后的市售 制剂样品各适量,分别加入一定体积的甲醇,固体制剂样品分别超声提取 1 h,放至室温后补足失重,离心取上清液各适量,加甲醇稀释至含左氧氟沙星约 2 gmL-1,备用。液体制剂样品直接用甲醇稀释至 相应浓度,备用。样品制备过程中随
13、行空白溶剂,得到空白样品溶液。 色谱条件采用 Agilent Zorbax SB-C18 (150 mm 4.6 mm,5 m) 色谱柱 (含在线过滤器 ); 流动相为甲醇 (A)-0.3%甲酸水 (B),采用梯度洗脱,进样前用起始流动相预平衡色谱柱 5 min,梯度洗脱条件为 t (min)/A%: 0/58/2218/2230/6035/6036/5; 柱温为 30 ; 流速为 1.0 mLmin-1,柱后分流约 30%注入质谱仪; 进样体积为 5 L。 质谱条件 在 ESI 正离子模式下检测,离子源温度为 450 ,喷雾电压 (IS) 为 5.5 kV,雾化气 (GS1) 压力为 60
14、psi (1 psi 6.9 kPa),辅助气 (GS2) 压力为 40 psi,入口电压 (EP) 为 10 V; 采用 MRM 扫描方式测定,Q1和 Q3 的分辨率均设为 Unit; 被列入 MRM 方法中的每个杂质选取 M+H+ 分子离子与两个相对丰度最高或特异的子离子组成离子对 (transition),对其解簇电压 (decluster potential,DP) 和碰撞能量 (collision energy ,CE) 进行了优化,优化后参数如表 1 所示。 Name Transition Dwell time/ms Decluster potential/V Collision
15、energy/eVDP-1 394.1305.1 394.1287.1 100 150 30DP-2 394.1294.1 394.1250.1 100 150 30DP-3 330.1286.1 330.1271.1 100 150 30DP-4 332.1261.1 332.172.0 100 150 30DP-5 346.1302.1 346.1260.0 100 150 30DP-6 334.1314.1 334.1277.0 100 150 30DP-7 292.1272.1 292.1235.1 100 150 30DP-8 318.1261.1 318.1270.1 100 17
16、0 37DP-9 364.1346.1 364.1289.1 100 150 30DP-10,11 394.1360.1 394.1316.1 100 150 30IMP-1 376.1332.1 376.172.0 100 150 32IMP-2 390.1346.1 390.1318.1 100 150 30Levofloxacin 362.1318.1 362.1261.1 50 140 28DP-12 336.1298.1 336.1318.1 100 130 34DP-13 322.1304.1 322.1284.1 100 150 30DP-14 348.1304.1 348.1261.1 100 140 28DP-15 378.1317.1 378.1361.1 100 140 32DP-16 279.126
