《沉淀反应》ppt课件-2

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1、第五章 沉淀反应 (precipitation reaction),指可溶性抗原与相应抗体在适当条件下发生特异性结合而出现的沉淀现象。,沉淀反应,+,-,形成肉眼可见的大的免疫复合物,反应慢。 沉淀线或沉淀环的观察以及免疫比浊法中的终点法就是测定此阶段形成的复合物,第一阶段,第二阶段,沉淀反应分两个阶段,抗原抗体特异性结合，快速但不可见。 免疫比浊法中的速率法就是利用此阶段测定免疫复合物形成的速率。,沉淀反应的原理,抗原与抗体反应,多克隆抗体非常适用于免疫沉淀试验。 单克隆抗体 抗原表面只有一种表位，不易形成交联， 单克隆抗体一般不适用于免疫沉淀试验， 抗原表面有2个以上相同的表位，单克隆抗体

2、也可用于免疫沉淀试验。 R型抗体：沉淀反应中多用。,环状沉淀试验 絮状沉淀试验,单向扩散试验 双向扩散试验,对流免疫电泳、火箭免疫电泳、免疫电泳、免疫固定电泳,液相沉淀 试验,凝胶沉淀 试验,免疫电泳 试验,沉淀反应分类,免疫浊度 试验,免疫投射浊度测定 免疫散射浊度测定,第一节 液相沉淀试验 （自学）,液相沉淀试验 是指可溶性抗原与抗体在含电解质的液体介质中反应，形成肉眼可见的沉淀物。 经典的液相沉淀试验： 絮状沉淀试验 环状沉淀试验,第二节 凝胶沉淀试验 （gel phase precipitation）,指可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散，形成浓度梯度，在抗原抗体相遇并且浓度比例适当的位

3、置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。 常用的凝胶：琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰胺凝胶。,原 理,凝胶孔径3nm，抗原或抗体分子（3nm）可在其中自由运动。分子越大，扩散越慢，可据此识别分子量的差异。 当抗原抗体结合形成抗原抗体复合物，分子量在百万以上，则被网络在凝胶中，出现肉眼可见的沉淀物。,凝胶沉淀试验的分类,单向免疫扩散试验 （single immunodiffusion test） 双向免疫扩散试验 （double immunodiffusion test）,一、单向免疫扩散试验,（一）原理 待测抗原溶液在含有相应抗体的凝胶内自由扩散，在二者比例适当处出现白色沉淀环，沉淀环的大小与抗原浓度

4、呈正相关。 用一系列已知浓度的抗原标准品进行试验，绘制标准曲线作为标本中抗原定量的依据。,（二）技术要点,用电解质溶液配制10g/L的琼脂糖凝胶，加热溶解后，放56水浴平衡温度； 琼脂糖冷至56后，加入一定量的抗体血清，充分混匀； 倾注琼脂糖板，琼脂糖厚2mm，凝固后打孔，孔径3mm，孔距1012mm； 孔内定量加入待测抗原溶液或不同浓度的抗原标准品溶液； 湿盒37，2448h，测量沉淀环的大小。,倾注平板 打孔 加样 放置37,2448h观察沉淀环,单向扩散试验（平板法）,俯视图,侧面图,打孔,抗体,抗原,单向扩散试验结果 上排为5个不同浓度的参考品； 下排为患者血清。,1. Mancini

5、曲线： 大分子抗原（IgM） 时间扩散48h， 常数 CKd2 普通坐标纸曲线,C为抗原浓度， d为沉淀环直径， K为常数,（三）数据处理,T1为1624h；T2为2448h；T3为48h以上,可见T3为直线，T1为反抛物线,Mancini曲线,2. Fahey曲线： 小分子抗原（IgG,IgA） 扩散时间24h 常数logC=kd 半对数坐标纸曲线,C为抗原浓度， d为沉淀环直径， K为常数,t1为1624h；t2为2448h；t3为48h以上,可见t1为直线，t3为反抛物线,Fahey曲线,（四）应用与评价,本法为经典抗原定量技术，常用于IgG、IgA、IgM、C3、C4等血浆蛋白的定量测

6、定。 若将一定浓度的抗原加入凝胶中，也可检测抗体浓度，称为逆向免疫扩散试验（reversed immunodiffusion test），其主要用于荧光抗体、酶标抗体和抗血清中抗体蛋白含量的测定。 操作简单，无需特殊设备，重复性和线性均可信。但灵敏度稍差（1.25mg/L），耗时长，影响因素多。,（一）原理： 将抗原抗体分别加在凝胶板不同的对应孔中，两者在凝胶中自由扩散，在比例合适处形成白色沉淀线。,（二）技术要点： 平板玻璃上倾注一层均匀的琼脂糖薄层，凝固后打孔（成对或梅花形），孔径为3mm，孔间距在35 mm之间，在相对的孔中加入抗原或抗体，放置湿盒372448h 后，观察孔周围是否出现沉

7、淀线。,鉴定抗原抗体的最基本、最常见的方法之一,二、双向扩散试验,抗体,抗原,（三）影响因素,1.抗原抗体特异性要强，否则将会出现交叉反应，导致假阳性结果。 2.抗原抗体比例要适当，二者比例适当时，出现一条清晰的纤细的沉淀线。若比例不适当沉淀线将变得宽而模糊，甚至不出现沉淀线，导致假阴性结果。 3.温度低，抗原抗体反应慢；分子越大，扩散速度越慢，时间越长。 4.琼脂板厚度也将影响实验结果。,（四）应用与评价,1.抗原或抗体的定性分析 用已知抗体（或抗原）检测未知抗原（或抗体）。 2.抗体效价测定 在梅花形孔的中央孔放定量抗原，周边孔放不同稀释度的相应抗体，以出现沉淀线的抗体最高稀释倍数为该抗体

8、的效价。,Ag,Ab,Ab效价为1：16,3.抗原或抗体的纯度鉴定,一对相应抗原抗体结合后，只能形成一条沉淀线，若出现多条沉淀线，说明不纯。,4.抗原、抗体的相对分子量和相对浓度的估计,分子量大者，扩散慢，扩散圈小，局部浓度较大，沉淀线弯向分子量大的一方，若二者分子量相当，则成直线； 浓度大，扩散速度快，且需扩散较远的距离被稀释后，才能形成抗原抗体合适比，沉淀线靠近浓度低的一方。,5.抗原性质分析,A:两条沉淀线完全融合，表明抗体与两个抗原中的相同表位结合而沉淀，但这并不意为着两个抗原必定完全相同。 B:沉淀线交叉，表明两个抗原完全不同； C:两条沉淀线相切，表明两个抗原部分相同，二者都有表位

9、1，但其中另一个抗原还含有表位2。,操作简单，无需特殊设备。 特异性高，结果可靠，成本低廉。 灵敏度低，耗时长，不能精确定量。,评 价,优点： 1.加快反应的速度。 2.提高了灵敏度。 3.增加了分辨率。,电泳分析,沉淀反应,抗原抗体反应 的高度特异性,电泳技术的高分辨 率、快速、微量,第三节 免疫电泳技术,原理： 双向扩散+电泳 在pH8.6的琼脂凝胶中， 抗原蛋白：等电点45，带较多的“-”，且分子较小，向正极的泳动速度大于向负极的电渗，抗原泳向正极； 抗体蛋白：等电点较高，带较少的负电荷，且分子较大，向正极的泳动速度小于向负极的电渗，抗体泳向负极。,一、对流免疫电泳,通电,Ag,蛋白质抗

10、原常带较强的负电荷，在电场中向正极移动,抗体球蛋白 带负电荷较少，籍电渗作用向负极泳动,Ab,正极,负极,对流免疫电泳原理,沉淀线,应用与评价,用于抗原或抗体的定性分析、效价测定和纯度鉴定等。 灵敏度比双向免疫扩散试验高816倍。 分辨力低于双向免疫扩散试验。 不适宜于抗原为免疫球蛋白的情况，因这会导致电泳时抗原抗体朝一个方向泳动。,电泳时凝胶中抗体不移动，样品孔中的抗原向正极泳动，随着抗原量的逐渐减少，抗原泳动的基底区越来越窄，抗原抗体分子复合物形成的沉淀线逐渐变窄，形成一个形状如火箭的不溶性复合物沉淀峰，抗体浓度固定时，峰的高度与抗原量呈正相关。,原理,单向免疫扩散电泳,定量检测技术,二、

11、火箭免疫电泳,火箭免疫电泳示意图,应用与评价,用于抗原蛋白定量，如IgA、IgG、IgM和SIgA，C3和C4及其裂解产物，AFP等。 若琼脂中加定量抗原可检测标本中抗体的含量，称为反向火箭免疫电泳（reversed rocket immunoelectrophoresis）。 本法影响因素多，现应用较少。,原理：区带电泳双向扩散 1、电泳：将蛋白质抗原在凝胶中电泳分成肉眼不可见的若干区带 2、双扩：沿电泳方向挖一与之平行的抗体槽，加入相应抗血清进行双向扩散 。,三、免疫电泳,+,-,-,抗体槽,Ag,+,-,+,1.电泳分离抗原,2.在槽内加抗血清,3.实验结果,M：骨髓瘤患者血清免疫电泳图

12、 N：正常人血清免疫电泳图,应 用,纯化抗原或抗体的成分分析，粗略检测其纯度。 正常和异常体液中蛋白质组成分析，如无丙种球蛋白血症、多发性骨髓瘤等病人的血清蛋白成分分析； 不同抗体成分的研究，如免疫后抗体组分的动态变化。,评 价,方法简单，样品用量少，特异性高，分辨率高，可分出人血清中2030种蛋白质。 沉淀线的数目和分辨率受多种因素的影响，判定结果要慎重。,四、自动化免疫电泳,1.电泳系统 2.光密度扫描系统,第四节 免疫浊度测定,应用抗原、抗体在液相中特异性反应，形成免疫复合物微粒对光线的干扰，可用仪器检测的特点，对可溶性抗原定量，将现代光学仪器与自动化分析检测系统相结合应用于沉淀反应。

13、特点：操作简便、快速、易于自动化，而且灵敏度较高。,基本原理,在抗体过量且固定的条件下，形成的免疫复合物量随抗原量增加而增加，反应液的浊度亦随之增强，即待测抗原量与反应后溶液的浊度呈正相关。 用一系列已知浓度的抗原标准品进行试验，制备剂量-反应曲线，即求出标本中抗原含量。,小分子可溶性免疫复合物（19S）,免疫复合物微粒（19S）,反应液出现浊度,增浊剂,可溶性抗原 + 抗体,根据检测器的位置及其所检测的光信号性质不同，免疫浊度测定分为： 免疫透射浊度测定（turbidimetry）：检测透射光强度 免疫散射浊度测定（nephelometry）：检测散射光强度,一、免疫透射浊度测定,（一）原理

14、 一定波长的入射光线通过抗原抗体反应后的混合液时，被其中的免疫复合物微粒吸收、衍射、反射和折射而减弱，在一定范围内，吸光度与免疫复合物量呈正相关，而形成的免疫复合物量与参与反应的抗原和抗体的量呈函数关系。与已知浓度的抗原标准品比较，可确定标本中抗原含量。 免疫复合物颗粒大小约35nm100nm，对近紫外光的干扰最大（最大吸收峰），选择290nm410nm波长测定最佳，目前多用340nm。,（二）技术要点,1.将待检标本和抗原参考品作适当稀释； 2.将抗原标准液（5或6个浓度）和待检标本与适当过量的抗血清混合，在一定条件下，抗原抗体反应完成后，在340nm处测定各管吸光度； 3.按log-log

15、it转换或y=ax3+bx2+cx+d方程进行曲线拟合，制备剂量-反应曲线，以此作为标本中抗原的定量依据。,（三）注意事项,1.在标本收集、保存和处理过程中，需防灰尘等能散射光的物质。 2.血清样品最好在稀释后测定。 3.计算时需扣除标本、抗血清和试剂本底。 4.每更换一批试剂，重新制作剂量-反应曲线。,（三）方法评价,优点: 灵敏度高，稳定性好，操作简便，结果准确。,不足: 抗体用量较大； 溶液中存在的抗原抗体复合物分子应足够大 透射比浊测定在抗原抗体反应的第二阶段，检 测需在抗原抗体反应达到平衡后进行，耗时较长。,1.粒子对光线的散射作用： 溶液中的微粒子受到光线照射后，微粒子对光线产生反

16、射和折射而形成散射光。 悬浮微粒对光散射形成的散射光强度与微粒的大小、数量、入射光的波长和强度、测量角度等因素密切相关，其公式如下：,二、免疫散射比浊法,(一) 原理,I：与入射光成角处散射光强度； 和I0：为入射光的波长和强度； dn/dc为校正因子，反映了溶液折射指数和颗粒浓度的变化； M为颗粒分子量； c为浓度； N为阿佛加德指数；为颗粒到检测器的距离； 为散射光与入射光的夹角（散射夹角）。,I I042（dn/dc) 2 Mc(1+cos) N24,Rayleigh散射：当粒径小于入射光波长的1/10时，散射光强度在各个方向的分布均匀一致 Debye散射：当粒径大于入射光波长的1/10或接近入射光波长时，散射光呈明显的不均匀分布，向前散射光大于向后散射光 Mie散射：当粒径等于或大于入射光波长