《流式细胞仪(flowcytometer)基本原理》由会员分享，可在线阅读，更多相关《流式细胞仪(flowcytometer)基本原理（34页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1 1、流式细胞术简介、流式细胞术简介 流式细胞术（流式细胞术（F Flow low C Cytoytom metryetry，FCMFCM）是以流式细胞仪为检）是以流式细胞仪为检 测手段的一项能快速、精确的对单个细胞测手段的一项能快速、精确的对单个细胞( (或生物学颗粒或生物学颗粒) )的的 理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。 流式细胞仪（流式细胞仪（Flow CytometerFlow Cytometer ）是集细胞与分子生物学、）是集细胞与分子生物学、 流体力学、激光技术、光电子技术、计算机技术、细胞荧光流体力学、激光技术、光电子技术、计算机
2、技术、细胞荧光 化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种高科技仪器。化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种高科技仪器。 流式细胞术的特点流式细胞术的特点 检测对象：单细胞悬液或生物颗粒；检测对象：单细胞悬液或生物颗粒； 检测参数：多参数；检测参数：多参数； 检测特点：单细胞水平分析；检测特点：单细胞水平分析； 检测速度：高速，最高达上万个细胞检测速度：高速，最高达上万个细胞/ /秒；秒； 检测结果：精度高、准确性好；检测结果：精度高、准确性好； 可对目标细胞进行分选；可对目标细胞进行分选； 2 2、流式细胞术光信号检测、流式细胞术光信号检测 光信号的类型光信号的类型 散射光信号散射光信号：与标记荧光
3、素无关，与标记荧光素无关， 是细胞的固有参数。是细胞的固有参数。 前向散射光前向散射光(forward scatter, FSC)(forward scatter, FSC)； 侧向散射光侧向散射光(side scatter, SSC)(side scatter, SSC)。 荧光信号荧光信号 自发荧光：微弱（核黄素、色素分子等）；自发荧光：微弱（核黄素、色素分子等）； 特异荧光：荧光素分子发出的的荧特异荧光：荧光素分子发出的的荧 光比自发荧光强很多倍。光比自发荧光强很多倍。 前向散射光前向散射光FSCFSC 激光器正前方激光器正前方1 1 - -6 6度方向上有比较强的衍射光，即前向散射度方
4、向上有比较强的衍射光，即前向散射 光，光，FSCFSC强度是强度是d/d/的函数的函数( ( 表示波长，表示波长，d d指细胞大小指细胞大小) )， 所以所以FSCFSC反映被测细胞的反映被测细胞的体积大小和活力体积大小和活力。 侧向散射光侧向散射光SSCSSC SSCSSC方向与激光束和液流形成的平面相垂直，亦称方向与激光束和液流形成的平面相垂直，亦称9090度散射度散射 光，其信号强度反映光，其信号强度反映细胞内部颗粒度和精细结构的变化细胞内部颗粒度和精细结构的变化。 散射光的作用散射光的作用 实验中，常利用实验中，常利用FSCFSC和和SSCSSC这两种参数的组合，区分不同的细这两种参数
5、的组合，区分不同的细 胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。 粒细胞粒细胞 单核细胞单核细胞 淋巴细胞淋巴细胞 红细胞、死细胞和碎片红细胞、死细胞和碎片 通过通过FSC/SSCFSC/SSC散点图，散点图，gategate出目标细胞进行分析。出目标细胞进行分析。 死细胞死细胞 或碎片或碎片 粘连粘连 细胞细胞 肿瘤细胞株肿瘤细胞株FSC/SSC散点图散点图 死细胞死细胞 加药处理后加药处理后FSC/SSC散点图散点图 阈值：阈值：Threshold/TriggerThreshold/Trigger 阈值阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的
6、干扰信号，所以必：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信号，所以必 须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的死细胞。须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的死细胞。 FSCFSC反映细胞体积的大小，反映细胞体积的大小，FCMFCM应用时常选取应用时常选取FSCFSC设定阈值。设定阈值。 5%32% 默认阈值默认阈值升高阈值后升高阈值后 荧光素和荧光信号荧光素和荧光信号 荧光荧光： 荧光素的电子吸收光的能量由低能态转变为高能态，荧光素的电子吸收光的能量由低能态转变为高能态， 再回到低能态时释放出的光。再回到低能态时释放出的光。 发射波长发射波长(荧光波长荧光波长) Emission
7、wavelength 激发波长激发波长 Excitation wavelength 常用荧光素常用荧光素 PE-Medianpos FL1-FITC stain Overcompensated 多色实验中，阴性对照和单染对照并不是严谨的设门对照，多色实验中，阴性对照和单染对照并不是严谨的设门对照， FMOFMO对照区分阴性群体和阳性群体更准确。对照区分阴性群体和阳性群体更准确。 F Fluorescence luorescence M Minus inus O One ne 荧光减一对照荧光减一对照 D D、 FMOFMO对照对照 FITC (-) PE PE 补偿调节引起背景荧光增强。补偿调节引起背景荧光增强。 颜色越多背景荧光越强，限制了多色流式技术的发展。颜色越多背景荧光越强，限制了多色流式技术的发展。 多色实验中，弱表达抗原必须设置多色实验中，弱表达抗原必须设置FMOFMO作为作为gating controlgating control。 双标试验中，单染管相当于双标试验中，单染管相当于FMOFMO对照。对照。 TregTreg检测中检测中CD4/CD25/IgGCD4/CD25/IgG即为即为FMOFMO对照。对照。
