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1、从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果多参数流式细胞术分析415例成人和儿童B 作者：刘艳荣，陈珊珊， 常艳， 付家瑜， 张乐萍，王卉， 李玲娣，主鸿鹄， 刘桂兰，陆道培， 黄晓军 【摘要】 为了探讨FCM在微量残留病检测中的意义，利用4-6组4色抗体组合，以CD45/SSC设门法对273例成人和142例儿童B系急性淋巴细胞白血病患者进行了多参数流式细胞术免疫分型检测和白血病相关免疫表型 分析 。结果表明：根据CD34和CD10的表达特点，可将B-ALL患者分为I型；型；型；型。型和型患者LAIP的
2、阳性比例分别为100%和92%，但型患者LAIP阳性率只有%,显著低于型和型患者。总体B-ALL患者LAIP的检出率为90%，成人与儿童组无明显差异。而利用CD34/CD10/CD19/CD45一组抗体，LAIP检出率达到%。结论：0%成人和儿童B-ALL白血病患者具有LAIP，因此对这类患者适宜用多参数流式细胞术进行MRD监测。 【关键词】 急性B系白血病；白血病相关免疫表型;多参数流式细胞术 Leukemia-Associated Immunophenotypes in1 Childhood and Adult Patients with B Lineage Acute Lymphobla
3、stic Leukemia by Multiparametric Flow Cytometry Analysis AbstractTo evaluate the significance of FCM in minimal residual disease(MRD)detection,the immunophenotyping and leukemia-associated immunophenotypes (LAIP)of leukemia cells from7adult and 14childhood patients with B lineage acute lymphoblastic
4、 leukemia (B-ALL) were detected by four to six antibody combinations of-color CD45/SSC gating multiparametric flow cytometry (FCM). The results showed that the B-ALL patients could be classified into subtypes based on different expression CD3and CD10 : subtype , subtype , subtype , subtype . The LAI
5、P was observed in 100% and2% patients of subtype and subtype , respectively, whereas % in subtype . The incidence of LAIP in total B-ALL cases was0% by using the antibodies detected in this investigation. There was no significantce different for incidence of LAIP between adult and pediatric patients
6、. LAIP was observed % of patients by labeling only CD34/CD10/CD19/CD45-color antibody combination. It is concluded that in0% of childhood and adult B-ALL patients LAIP can be found, which suits MRD detection by multiparameter flow cytometry. Key wordsacute B lineage leukemia; leukemia-associated imm
7、unophenotypes； multiparametric flow cytometry B细胞型急性淋巴细胞白血病免疫亚型的MIC诊断标准自1985年起一直沿用至今，并且被新的WHO分类标准所采用。该标准根据胞浆免疫球蛋白和细胞核内抗原TdT及表面免疫球蛋白、HLA-DR和CD10，将B-ALL分为：early-precursors-B-ALL, commom-B-ALL, pre-B-ALL和B-ALL4亚型。用流式细胞仪检测胞浆抗原的表达，操作较烦琐，有一定难度，且结果不稳定，因此其在临床的常规检测中 应用 受到限制。1997年 Jennings 等1提出将 B-ALL 分为： B-p
8、recursor-ALL, pre-B-ALL和B-ALL3亚型，又将B-precursor-ALL,分为CD10+和CD10-两类。该系统在MIC基础上加入CD34、CD20、CD22、CD24、CD9抗原。近几年多参数流式细胞术的开发和应用促进了对正常B细胞分化阶段抗原表达的认识，但是否可通过简便的抗原检测而达到对B-ALL进行亚型的分型，本 研究 对此进行了初步探讨。虽然B-ALL患者的白血病细胞在抗原表达类型和出现的顺序与正常B祖细胞基本相似，但白血病细胞具有一些正常细胞不存在或存在比例较低的抗原表达特点，可作为辨认白血病细胞的标志， 文献 上对其称为白血病相关免疫表型2。利用FCM通
9、过检测LAIP可对B-ALL微量残留病进行监测，这一 方法 已成为与聚合酶链反应并用的检测MRD的主要方法。 目前 国际上对B-ALL-MRD的检测结果多来自儿童患者，而且主要的研究对象为前体B-ALL。而成人B-ALL患者在免疫表型尤其是LAIP与儿童患者是否存在区别？FCM-MRD的检测是否同样适合于成人B-ALL患者？及儿童和成人不同亚型B-ALL患者中LAIP的阳性率是否相同？均不十分清楚。本室在掌握了正常B祖细胞免疫表型的基础上3，对415例成人和儿童B-ALL患者的上述 问题 进行了研究，以探讨其在MRD检测中的意义。 材料和方法 研究对象 XX年8月至XX年6月在我室进行免疫分型
10、检测的B-ALL患者共415例，其中初治409例，复发6例。成人组273例，中位年龄32岁，男160例，女113例。儿童组142例，中位年龄9岁，男89例，女53例。 B-ALL患者的免疫分型检测 取肝素抗凝的骨髓或外周血标本，利用我室设计的4色荧光直接免疫标记法进行B-ALL的免疫分型检测，以CD45/SSC设门，故每管均加CD45-PerCP抗体。主要标记4-6管4色抗体组合，检测的抗原分别为CD19、CD10、CD34、CD20，CD22，HLA-DR、CD13、CD33、CD14、CD5、CD7、CD2、CD38、CD117，CD11b等。经流式细胞仪(FACSort型，Becton
11、Dickinson公司，装备双激光管)测定时将正常淋巴细胞的CD45荧光值调到103左右。每份标本获取10 000个细胞。分析时以幼稚细胞群中抗原表达细胞20%作为阳性。由于在仪器设定时将正常淋巴细胞的CD45荧光值调到103左右，此时正常B系祖细胞的CD45全部101, 因此CD45抗原以90%细胞101定为CD4阳性，90%细胞101到 统计学处理 采用成对样本t检验和卡方检验。 结果 B-ALL免疫分型 本组B-ALL患者中，CD19全部阳性。由于正常B细胞的不同分化阶段CD34和CD10表达具有明显的阶段性，并且白血病细胞基本保留此特性，因此我们参考MIC分类标准，并主要根据CD34和
12、CD10的表达，将B-ALL患者共分为4亚型：型:CD34+/CD10-，相当于MIC分类Early-precursor-B-ALL(Pre-pre-B-ALL); 型:CD34+/CD10+,相当于普通B-ALL(c-B-ALL)；型:CD34-/CD10+，相当于前B-ALL。其它各型比例在儿童与成人和与总体相比均无显著性差异。Table 1. Frequency of immunophenotypic subtypes in adult and child patients with B-ALL B-ALL患者LAIP 分析 通过与正常 B祖细胞进行比较2，在总体B-ALL中LAIP的主
13、要表现为：抗原表达异常，以CD45表达异常减弱，缺如最为多见，在总体B-ALL患者中占%。而且在4个亚型中均可见到，这说明完全丧失了分化阶段的特性。其它抗原表达异常包括CD19、CD10、CD34异常高表达和异常低表达; 非同步抗原表达，如型、型和型B-ALL患者的白血病细胞，在正常CD19+B系细胞相应发育阶段除CD34和CD10抗原外， CD22、CD38和CD20表达应为CD22+CD38+CD20-、CD22+CD38+CD20+/-和CD22+CD38-CD20+;但白血病细胞可出现CD34+CD20+、CD34-CD10-CD20-、CD34-CD10-CD22-、CD34+CD3
14、8-、CD10+CD38-非同步抗原表达异常；交叉系列抗原表达，如同时表达髓系和T系标志。通过本 研究 所检测的抗体，415例B-ALL患者中373例患者具有可供MRD检测的LAIP，其中利用CD10/CD34/CD19/ CD45一组抗体，LAIP的检出率达到%。 Table. Incidence of LAIP in15 adult and child patients with B-ALL Note: st+-strong positive. B-ALL各亚型中白血病相关的免疫表型分析 本研究所检测的主要抗原的异常表达在各亚型中的比例见表3和表4。CD45和CD38异常弱表达和CD34、
15、CD19和CD10的强表达主要见于型患者，使型患者总体LAIP阳性率达%。CD33和CD56的异常表达以型患者多见，且正常CD19+B祖细胞基本不存在CD34+CD10-表型，此型患者全部为LAIP+，即均可通过免疫表型检测MRD。型患者由于CD34阴性，CD10表达也已经减弱，只有CD20全部阴性占%,高于型和型，但其他标志异常率也较低，其总LAIP+率只有%，比和型低，但只与型相比有统计学差异。对型患者，由于其CD34和CD10均为阴性，因此失去了2个非常有意义的标志，LAIP阳性率最低。与其它3型比均有统计学差异。但我们发现6/7例患者CD20为阴性，而此期的正常B细胞，CD20应强阳性，因此通过CD20的检测可能利于型患者MRD的监测。虽然表4显示型患者LAIP阳性率为%，但LAIP阴性的7名患者均未检测CD22和CD20，因此，如果每位型患者均检测此两种抗体，则实际LAIP阳性率可能会大大增加。Table. Frequency of LAIP positive patients in subtype of B-ALL (略) 成人和儿童组B-ALL患者白血病相关的免疫表型分析 表4显示成人和儿童组B-ALL患者白血病相关的免疫表型阳性比例，儿童组中LAIP阳性率为%，成人组为%, 两者无统计学差异。而儿童和成人B-ALL各亚型之间及与总体
