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1、,田代真一提出中药血清药理学方法的背景日本的汉方研究工作者都是中西医结合型专家，不可能缺乏生物医学基本知识。可以设想：他们应该知道正常人与非DIC病人体内血液中真实存在的液体成分是血浆，而不是血清；从胃肠道吸收的中药成分是进入血浆，并非血清。联系当时历史条件的局限性，许多人认为血浆等于血清加纤维蛋白原。他们提出中药血清药理学方法很可能是不了解血浆与血清的实际差异。随着科学与技术发展，时至今日，血浆与血清多方面的差别已逐步揭开。,Crosstalk of coagulation 185:5628-5636),8，凝血和相关过程对核酸类的影响 （1）RNA与刺激与损伤血细胞，引起血清中RNA Ch
2、eng HH, et al.,2013）,9， 凝血和相关过程对重要活性物质的影响（1）生长因子：来自血小板释放PDGF,VEGF, EGF, CTAP,TGF-等。（2）氧化与抗氧化体系：N释放O-2 二者生成ONOO- ；而RBC & Plts释放GSH-Px, SOD, catalase, GSH-redutase(GR)。,（3） 细胞肽类（cytokines，细胞因子)：在常测的15种细胞肽中，血清的IL-6含量明显低于血浆，CXCL-8含量明显高于血浆。肝素抗凝血浆对细胞肽类检测的稳定性最好。（de Jager W, et al., 2009; Considerations for
3、 measuring cytokine levels in serum or plasma. Posted on May 28, 2013 by Andrea in PBMC Basics ）,10, 凝血和相关过程导致血浆与血清蛋白、 及 肽类差异二维凝胶电泳显示血清与血浆差异蛋白约53个，其中仅出现在血清中的有9个（Kim HJ, et al.，2007）；蛋白与肽组学研究发现血清中质谱信号约3000-7000，其中40%以上仅出现于血清中，并不见于血浆（Schulte I, et al.， 2005；Tammen H, et al.，2007）。（如将血清信号数量多视为优点是错误的） 3
4、9 例 Alzheimers 病(AD) 患者血清与血浆自身配对， 检测100 个蛋白，结果仅40个高度相关。（Huebinger RM., et al.,2012)HUPO和有关专家根据血浆与血清差异， 从反映体内实际情况考 虑 ，一致认为蛋白组学和肽组学研究应采用血浆。（Omenn GS, et al.，2005 & 2011；Thadikkamn I, et al.，2005） 在癌症蛋白 组学中，血清 标本易发生误导，以血浆 为宜。(Baggerly KA, et al., 2004),11, 凝血和相关过程导致血浆与血清中代谢产物的差异 有关专家根据血浆与血清差异， 从反映体内实际情
5、况考 虑 ，认为代谢组学研究应采用血浆为宜。（Teahan O, et al.，2006） 有报道血浆代谢产物指纹谱的可重复性优于血清。（Yu Z, et al.，2011）小细胞性肺癌患者血浆中的甘油磷酸胆硷(glycerophosphocholines)、赤藓醇（erythritol）、 棕榈酸（hexadecanic acid)和 谷氨酰胺（glutamine）含量与预后显著相关；但血清并无这种关系。（WedgeDC，et al., 2011） 对于胆固醇类指纹谱虽血浆与血清存在差别，二者相关性尚好；但在不同年龄段儿童研究中，采用 血浆更优。（Berentzen N.E., 2013）
6、国人报道血浆与血清代谢产物存在差异，但血清孵育对分析峰面积影响小于血浆， 故认为代谢组学研究以血清为好。（Liu L, et al., 2010）,小结 血浆是体内循环体内循环血流中的液体成分。 血清是 体外血液凝固后去除凝块（含纤维蛋白和血细胞）的液体成分。正常人与患者体内循环血流中的液体成分并非血清。 制备血清的凝血和相关过程,致使血清成分在多方面偏离血浆。有些成分减少甚至消失，同时又产生许多新的成分。血清= 血浆- 纤维蛋白原与/或消耗因子 概念是错误的。 血浆较血清接近体内真实情况。,制备血清与预处理可能带耒的影响制备血清的影响凝血酶和弹性蛋白可能对某些中药成分（尤蛋白-肽类）具有降解
7、作用。在除去纤维蛋白过程中可能会发生中药成分共沉淀现象。在除去血细胞过程中可能会发生被吸附的中药成分丧失。血清预处理的影响 通常采用物理（加热）或化学（乙醇/丙酮）变性手段试图消除血清非药的活性。这些预处理可能导致以下影响 中药成分损失-直接或间接（吸附于沉淀蛋白的成分） 药物介导的活性成分损失 血清成分(特别是蛋白类)*已有报道：以蛋白组学方法，观察560C1小时对血浆和血清中100个可溶性蛋白的影响。 结果：血浆热处理后，36个蛋白出现差异；血清热处理后, 19个蛋白出现差异。 这些差异蛋白涉及趋化肽、生长因子、金属蛋白酶和粘附分子等类(Ayache S, et al., 2006),中药
8、药学专家述评 没有一种实验方法是完美的,血清药理学从提出伊始就存在一些难以解决的问题。血清药理学要想真实反映药物在机体内的生物效应,就需要克服可能干扰实验结果和作出结论的多种不利因素。（韩 笑, 等。2009） 新近报道从应用层面也指出血清药理学方法存在诸多具体问题，它并不是中药药理体外实验的适宜方法。（张红敏，等，2011）,(3) 含药血清与对照血清的可比性可能存疑 对照是实验设计的首要原则有效对照必须是实验组(处理组)与对照组之间的非处理因素 齐同； 只有这样， 才能排除非处理因素对实验结果分析/判断 的干扰。设处理因素为T ，非处理因素为C, 则施加因素 测试效应(I) 实验组 : T
9、 + C ET + Ec(II)对照组 : C Ec-(I) (II) T = ET 关键在于组间C相等,原因 凝血及相关过程产生的活性物质 非药效应 实验组 对照组Ec （违背齐同对比原则 丧失对照意义） 干扰实验结果假阳性或假阴性结论,举例：血小板源生长因子（PDGF）血小板能够表达血小板源生长因子（PDGF），其中包括VEGF等多种生长因子。 平时这些生长因子储存在夥粒中。血液凝固时，凝血酶刺激血小板释放生长因子。 据报道血清中VEGF含量约为血浆5-10 倍。（Verheul HM, et al., 1997;Webb NJ, etal.,1998; Maloney JP, et al
10、.,1998; Wartiovaara U, et al.,1998; George ML, et al.,2000)（血小板裂解物促进伤口癒合；细胞培养时常加胎牛血清）具有促凝或抗凝的药物通过改变凝血酶生成量，均可影响血小板PDGF的释放量，使含药血清中VEGF含量不同于无药对照血清；从而改变细胞繁殖与生长的速度 ，因此干扰以细胞繁殖为指标的实验。,涉及中医“气”、“血”的中药可能影响凝血及其相关过程Ex: 筛选抑制癌细胞生长复方 若复方中存在黄芪、赤芍、灵芝等具有抗凝作用。给药动物凝血酶生成减少, 使plts 释放PDGF 随之降低, 故含药血清中PDGF 低于对照血清, 可能导致假阳性结
11、果。 如复方中存在促凝或促plts活化药物， 则含药血清中PDGF 增加，可能导致含药血清中PDGF 高于对照血清, 可能导致假阴性结果。,含药血浆药学实验的可行性1，药学实验采用血标本首选血浆的理由 血浆成分较血清接近体内真实情况 血浆制备较血清简单，干扰因素相对少 血浆获量较血清多15-20%2，西药 （1）药代动力学研究西药药代动力学(pharmacokinetics) 与 药效动力学(pharmacodynamics)研究通常首选血浆已成常规。若抗凝剂干扰实验，则采用血清。,（2）西药药理ex vivo研究方法除in vivo，in vitro外，ex vivo实验如采用血标本时，通常
12、采用血浆。西药ex vivo药理 实验采用血浆举例药理作用选择性药效的影响因素药物对靶细胞的影响药物代谢产物及其相关酶,a，含药（西药）血浆进行药理作用选择性实验举例Ex vivo assay to determine the cyclooxygenase selectivity of non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) (Giuliano F, et al., Brit J Pharmacol 1999)Triad Treatment(factor): NSAIDs Rats Blood(pre- TXB2 as index of C
13、OX-1 activityProtocol(outline): preparations of plasmas & cells mixture incubation (30min) induction (15min) supernatant index determinations analysis*A549, a human epithelial carcinoma cell line expresses COX-2 when exposed to IL-1.Production of PGE2 by this cell line can be used as an index of COX
14、-2 activity. *The production of thromboxane (TX) B2 by platelets was used as index of COX-1 activity.,ConclusionsI. The selectivity of NSAIDs is divided into: (a) Main action on COX-1: sulindac sulphide, aspirin(b) Main action on COX-2: nimesulide, diclofenac (c) Equal action on COX-1 &-2: sod. Sali
15、cylate II. The research strategy:It could be extended by the analysis of plasma samples taken from humans similarly treated with other test drugs.,b，含药（西药）血浆研究药效的影响因素举例Absolute Bioavailability of cis-Mirincamycin and trans-Mirincamycin in Healthy Rhesus Monkeys and Ex Vivo Antimalarial Activity agai
16、nst Plasmodium falciparum (Khemawoot P, et al., 2011)Triad Target factors: cis-mirincamycin vs trans-mirincamycinoral vs intravenousin vitro vs in vivo Object: Rhesus Monkeys Effect: antimalarial activity on W2 clone of Plasmodium falciparumDesign animal groups： cis oral, trans oralCis i.V, trans i.vblood sampling: at 0, 15, 30, and 60 min, 2, 4, 6, 8, 12, and 24 h, and 2 and 7 days; heparin anticoagulation; preparation of plasma containing drugspreparation of W2 clone of Plasmodium falciparum（恶性疟原虫）,
