第七章 酵母基因表达体系,,,,,酵母基因组特征,与真核生物的基因组相比，啤酒酵母的基因组很小，仅有16条染色体，含1.4X107 bp,编码约5000个蛋白质，是目前已知真核生物中基因组最小的一个酵母细胞既可以作为单倍体存在，也可以作为二倍体存在这就克服了在其它真核生物中隐性基因控制的形状难以检测的缺陷如果外源基因表达产物在酵母菌中具有对泛蛋白依赖型降解作用的敏感性，则可通过下列方法使这种降解作用减少到最低程度： 第一种方法是以分泌的形式表达重组异源蛋白，异源蛋白在与泛蛋白因子形成共价结合物之前，迅速被转移到分泌器中，即可有效避免降解作用; 第二种方法是将外源基因的表达置于一个可诱导的启动子控制之下，由于异源蛋白质在短期内集中表达，分子数占绝对优势的表达产物便能逃脱泛蛋白因子的束缚，从而减少由降解效应带来的损失; 第三种方法是使用泛蛋白因子生物合成缺陷的突变株作为外源基因表达的受体细胞;,在酿酒酵母中，泛蛋白因子的主要来源是多聚泛蛋白基因UBI4的表达，UBI4突变株能正常生长，但其细胞内游离的泛蛋白因子浓度比野生型菌株低得多，因此这种缺陷株是一个理想的外源基因表达受体 编码泛蛋白激活酶E1的基因也可作为突变的靶基因，含有该基因突变的哺乳动物细胞内几乎检测不出泛蛋白-外源蛋白的共价结合物。
酿酒酵母编码E1蛋白的基因UBA1是一种看家基因，UBA1突变株是致死性的，但编码UBA1蛋白等位突变株却可减少泛蛋白因子依赖型异源蛋白的降解作用此外，上述6个UBC基因的突变也是构建重组异源蛋白稳定表达宿主系统的选择方案，,,,,,,酵母菌的载体系统分为三种：质粒载体整合载体（integrating vector）人工染色体酵母质粒载体又分为：酵母附加型质粒(yeast episomal plasmid,YEp)酵母复制型质粒(yeast replicating plasmid,YRp)酵母着丝粒质粒(yeast centromere plasmid,YEp),酵母附加型质粒来源于野生型的酵母质粒，这种质粒存在于很多啤酒酵母株系中，功能不祥但有一个重要特点是，该质粒被一段长度约为599bp的反向重复序列分为两个部分，每一个部分都含有一个启动子和该启动子控制下的两个基因其中一个基因为FLP，它编码一个位点特异性的重组酶，这个酶可以催化反向重复序列之间的遗传重组 酵母附加型质粒就是在这种质粒的基础上，加入酵母核DNA序列，以及大肠杆菌pMB9的部分序列组成故其既可以在酵母中复制，又可以在大肠杆菌中复制。
酵母菌中天然存在的自主复制型质粒并不多，而且相当一部分野生型质粒是隐蔽型的，因此目前用于外源基因克隆和表达的载体质粒都是由野生型质粒和宿主染色体DNA上的自主复制子结构(ARS)、中心粒序列(CEN)、端粒序列(TEL)以及用于转化子筛选鉴定的功能基因构建而成2u质粒,几乎所有的酿酒酵母菌株中都存在一个6318bp大小的野生型2u双链环状质粒，它在宿主细胞核内的拷贝数可维持在50-100之间，呈核小体结构，其复制的控制模式与染色体DNA完全相同2u质粒上含有两个相互分开的599bp长反向重复序列(IRs)，两者在某种条件下可发生同源重组，形成两种不同的形态(A和B)该质粒上共有4个基因：FLP、REP1、REP2和D．其中FLP基因的编码产物催化两个IRS序列之间的同源重组，使质粒在A与B两种形态中转化，REP1、REP2和D基因均为控制质粒稳定性的反式作用因子编码基因．上述基因共转录出7种不同分子量的mRNA分子 2u质粒还含3个顺式作用元件．其中单一的自主复制子结构(ARS)位于一个IRs的边界上，REP3(STB)区域是REP1和REP2蛋白因子的结合位点．对质粒在细胞有丝分裂时的均匀分配起着重要作用，FRT存在于两个IRs序列中，大小为50bP，是FLP蛋白的识别位点。
在寄主细胞内极其稳定性主要由两个因素决定： 第一，2u质粒在细胞分裂时可将其复制拷贝均分给母细胞和子细胞. 第二，当细胞中质粒拷贝数因某些原因减少时，2u质粒可通过自我扩增自动调节其拷贝数水平 上述两种复制特性均与FLP蛋白的作用密切相关，这是2u质粒以有限的复制次数获得高拷贝的主要机制酵母复制型质粒来源于大肠杆菌质粒pBR322同时加入了一段酵母染色体的自主复制序列这种质粒一般不会与酵母染色体发生重组，它转化酵母的转化率很高，但是不能稳定遗传酵母着丝粒质粒：来源于酵母染色体的着丝粒周围的leu2和cdc10之间的一段1.6kb的序列带有此着丝粒序列的质粒在酵母中的行为类似一微型染色体，它可以稳定遗传，并均匀地分配到子代细胞中，同时在宿主细胞中的拷贝数很低 但是，含有着丝粒质粒的酵母细胞生长十分缓慢，而且细胞的生存能力下降整合载体：不含酵母的自主复制序列，因而不能在酵母中独立复制的一种载体这种载体必须在整合到酵母染色体上才能使其上所包含的基因得到稳定表达 在啤酒酵母中含有30～40个拷贝的可转移的遗传因子(Ty),其结构包括两个长OFR和两个长末端重复序列(LTR) , Ty可以整合到宿主细胞的染色体上。
如果在Ty的OFR2的3端与LTR的3端之间插入外源基因，外源基因就可以随Ty一起整合到酵母染色体上利用质粒上的营养成分生物合成标记基因互补相应的营养缺陷型受体菌，可以在不添加任何筛选试剂的条件下维持转化子中质粒的存在，但这种筛选互补模式并不稳定，而且对选择培养基的要求也很高，在大规模传统发酵中普遍使用的复合培养基一般不能用作这种转化菌的培养近年来发展起来的自选择系统是克服上述困难的的一种有效力法酿酒酵母的一种srb1突变株对环境条件极为敏感，它只能在含有渗透压稳定剂的培养基中正常生长，而在普通复合培养基中细胞会自发裂解用含有野生型SRB1基因的自主复制型多拷贝质粒转化这种突变株受体细胞，则只有转化子能在不含渗透压稳定剂普通培养基中生长，因此任何培养基均可用于转化细胞的筛选以及质粒的稳定维持更为优越的是，含有SRB1标记基因的多拷贝载体能在受体菌中稳定复制80代以上相对化学试剂或营养缺陷互补筛选程序而言，这种自选择系统具有更高的应用价值用于启动转录蛋白质结构基因的酵母菌II型启动子由基本区和调控区两部分组成，基本区包括TATA盒和转录起始位点在酿酒酵母中，转录起始值点位于TATA盒下游30-120bP的区域内，但非洲酒裂解酵母的mRNA合成位点紧邻TATA盒，与高等真核生物的启动子结构非常相似。
对于各种酵母菌的基因来说，II型RNA聚合酶启动mRNA合成的最佳位点位于TATA盒下游40-110bP区域内，酵母菌启动子的调控区位于基本区上游几百碱基对的区域内，由上游激活序列(UAS)和上游阻遏序列(URS)等顺式元件组成这些元件均为相应的反式蛋白调控因子的作用位点，并激活或关闭由TATA盒介导的基因转录，而反式蛋白调控因子的表达及其活性状态的改变又受到特异性信号分子的影响，由此构成酵母菌基因表达的时空特异性调控网络 广泛使用的酵母菌可控性启动子有:半乳糖启动子(GAL),酸性磷酸酶启动子(PHO),甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子(GAPDH),Cu2+螯合蛋白启动子(CUP1)等.,,,,,,当酿酒酵母生长在无半乳糖或葡萄糖存在的培养基中时．其GAL1、GAL7和GAL10启动子受到阻遏，加入半乳糖或葡萄糖时，启动子活性被诱导1000倍半乳糖的诱导作用与GAL4基因和GAL80蛋白质的性质密切相关，GAL4编码一种正调控蛋白，能与GAL1、GAL7和GAL10启动子上游的UAS特异性结台，GAL80蛋白则是GAL4因子的拮抗剂在一般情况下，GAL4基因的表达水平较低，限制了半乳糖诱导作用的程度,,,酵母菌tRNA与外源基因密码子的不匹配性不仅仅影响异源mRNA的翻译速率，更主要的是降低了mRNA的结构稳定性，两者共同导致外源基因表达水平的下降。