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1、酶的分离纯化,1、酶的提取与分离纯化技术路线,2、细胞破碎,3、酶的提取,4、酶的分离方法,Go,Go,Go,Go,5、酶的组合分离纯化策略,Go,6、酶的浓缩、干燥与结晶,Go,细胞结构与酶分布,1 酶的提取、分离纯化技术路线,细胞破碎,酶提取,酶分离纯化,酶浓缩,酶贮存,动物、植物或微生物细胞,发酵液,离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。,三个阶段： (1) 粗蛋白质 : 多使用 盐析沉淀法； (2) 部分纯化: 初步的纯化，使用各钟 柱层析法。 (3) 均质酶 : 目标酶的进一步精制纯化，可用制备式电泳 或 HPLC。,酶分离纯化不同阶段,2 细胞破碎
2、1）机械破碎 2）物理破碎 3）化学破碎 4）酶解破碎,JY92-II D超声波 细胞粉碎机,细胞破碎珠,高压细胞破碎机,DY89-I型 电动玻璃匀浆机,机械破碎,捣碎法 研磨法 匀浆法,物理破碎,温度差破碎法 压力差破碎法 超声波破碎法,通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。,通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。,细胞破碎方法及其原理,化学破碎,有机溶剂： 甲苯、丙酮 丁醇、氯仿 表面活性剂,酶促破碎,自溶法 外加酶制剂法,通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎,通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎,酶的提
3、取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。,3 酶的提取,酶的主要提取方法,大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为盐溶现象。,4 酶的分离方法,1)沉淀分离,2)离心分离,3)过滤与膜分离,4)层析分离,Go,Go,Go,Go,5)电泳分离,Go,6)萃取分离,Go,本章 目录,1)沉淀分离,沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。,中性盐的选择常用（NH4）2SO4，其突出优点：a. 溶解度大b. 温度系数小，分
4、离效果好c. 不易引起变性d. 价格便宜,盐析用盐,有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。例如，20时水的介电常数为80，而82乙醇水溶液的介电常数为40。,2)离心分离,离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。,（1）离心机的种类按离心机转速的不同，分为：常速（低速）高速超速,离心机的种类,实验室离心机,温度类型：常温及冷冻 超速离心机均为冷冻型。 使用冷冻离心机时提前降温，预冷离心头。 使用超速离心机时先抽真空。,离心的形式,角式及外摆式：外摆式一般为低速， 角式由低速到超速均有。,角式离心机和离心头（转子）,角式离心头要配套，低温使用要预冷，操
5、作注意稳、盖、旋紧。,离心机的大小：落地式及台式,小台式离心机,离心管,材质：玻璃，塑料 强度：和离心速度相配 大小：和转子配套 高速超速管要加盖,差速离心 （differential centrifugation） 采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法。 特点：用于分离大小和密度差异较大的颗粒。 优点：操作简单 。 缺点：1）分离效果较差， 不能一次得到纯颗粒。2）沉降的颗粒受到挤压。,差速离心分离示意图 （a）离心前的悬浮液 （b）（e）离心不同时间后颗粒的沉降情况,密度梯度离心 （density gradient centrifugation）样品在密度梯度介
6、质中进行离心，使沉降系数比较接近的组分得以分离的一种区带分离方法。 常用的密度梯度溶液是蔗糖溶液。,密度梯度离心示意图 （a）离心前 （b）离心后,密度梯度离心,步骤： A.形成密度梯度 B. 加样 C.离心 D.收集样品,等密度梯度离心 又称沉降平衡离心 （sedimentation equilibrium centrifugation）。根据颗粒的密度不同而进行分离。离心时，在离心介质的密度梯度范围内，不同密度的物质颗粒或向下沉降，或向上漂浮，达到与其相同的密度时不再移动，形成区带。,等密度梯度离心示意图 （a）离心前； （b）离心后,沉降速度离心和沉降平衡离心的特点,3)过滤与膜分离,过
7、滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。,过滤,非膜过滤,膜过滤,过滤的分类及其特性 (根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同 ),借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术称为膜分离技术。,膜分离,加压膜分离,微滤 超滤 反渗透,电场膜分离,电渗析 离子交换膜电渗析,扩散膜分离,透析,4)层析分离,亦称色谱技术。它是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的，另一个相则流过此固定相并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。,a. 原理示意图,b.层析分离方法,吸附层析是利用吸附剂对不
8、同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离的方法。,分配层析是利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离的方法。,纸层析 分配薄层层析 分配气相层析,离子交换层析是利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法。,按活性基团的性质不同，离子交换剂可以分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。,凝胶层析又称为凝胶过滤，分子排阻层析，分子筛层析等。是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。,常用的凝胶：葡聚糖凝胶琼脂凝胶与琼脂糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶,亲和层析是利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆
9、的亲和力，而使生物分子分离纯化的技术。,根据欲分离组分与配基的结合特性，分为：共价亲和层析疏水层析金属离子亲和层析免疫亲和层析染料亲和层析凝集素亲和层析,5)电泳分离,a.电泳的原理:,在一定pH条件下不同大小、形状及带电颗粒在电场中的移动速度不同，各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。,按支持介质种类的不同，区带电泳可分为：纸电泳：多用于核苷酸的定性定量分析。醋酸纤维素薄膜电泳：常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白,b. 电泳的分类,琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。 聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。分辨
10、率较高。 聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质。,c. 电泳常用设备 （1）电泳仪 ：为电泳提供稳定直流电源的装置 。常压电泳仪（600V）高压电泳仪（3000V） 超高压电泳仪（30000V50000V） （2）电泳槽： 管状电泳槽板状电泳槽（3）附属设备：,水平板式电泳槽,垂直板式电泳槽,聚丙烯酰胺凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。,1.原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acrylamide，简称Acr）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（methylane b
11、isacrylamide，简称Bis）在催化剂和加速剂作用下聚合的。,聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种： 1）化学催化系统：AP-TEMED催化剂：过硫酸铵（ammonium persulfate，AP）加速剂：TEMED（N，N，N，N-四甲基乙二胺） 2）光催化系统：核黄素光（TEMED）催化剂: 核黄素（维生素B2）引发剂: 光TEMED的存在，可加速聚合。,.,聚丙烯酰胺凝胶： 丙烯酰胺N,N甲叉双丙烯酰胺聚合而成,凝胶的机械强度、弹性和透明度粘着度取决于凝胶总浓度（T）和交联度（C）。T= C= 凝胶浓度越大（小），孔径越小（大），可分离分子量较小（大）的颗粒。Acr与Bis的重量
12、比应在30左右。,凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系,Acr（g）+Bis（g）,V（ml）,X100%,Acr（g）+Bis（g）,Bis（g）,X100%,聚丙烯酰胺凝胶浓度参考表,2. 分类 PAGE根据其有无浓缩效应，分为： 连续电泳（continuous electrophoresis）采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统 不连续电泳（discontinuous electrophoresis） 采用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系电荷效应 不连续PAGE 分子筛效应浓缩效应,连续PAGE,1）电荷效应 : 分离胶中，蛋白质表面净电荷不同，迁移率不同。 2）分子筛效应 ：大小和形状不同的样品
13、分子通过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。 3）浓缩效应：使样品在浓缩胶中被浓缩成一条窄带，然后再进入分离胶进行分离。,不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳,系统的不连续性表现在以下几个方面：1.凝胶由上、下两层凝胶组成，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。2.缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。 3.在电场中形成不连续的电位梯度。,8.3,8.3,8.9,6.7,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate- polyacrylamide gel electrophoresis, SDS- PAGE）简称SDS
14、 PAGE。是目前测定蛋白质亚基相对分子量（relative molecular mass, Mr）的一种最好的办法 。,SDS-PAGE separates proteins by MW,1.原理：SDS是一种阴离子去污剂，带有大量负电荷因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异。SDS破坏蛋白质氢键、疏水键，巯基乙醇使二硫键打开，引起蛋白质构象改变，使蛋白质SDS复合物形状近似椭圆形，短轴相同（1.8nm），长轴与蛋白质分子量成正比。因此，蛋白质SDS复合物(SDS-denatured protein)在凝胶中的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与蛋白质分子量有关。,两者关系：蛋
15、白质的迁移率与分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX MW：分子量；X：迁移率；k、b均为常数将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据其相对迁移率即可在标准曲线上求得分子量。,2. 操作：（SDS-PAGE及PAGE，即变性及非变性） 1）制胶: （变性：buffer 中加0.4%SDS）a. 分离胶：根据待分离样品的分子大小选择一定浓度的分离胶，配制分离胶溶液：Acr:Bis=29:1，分离胶buffer, TEMED, AP, 水迅速倒胶，加水使液面平坦，室温0.5h聚合完全。b. 浓缩胶：用浓缩胶buffe
16、r。插上梳子。,2）样品制备：a. PAGE: 样品样品缓冲液（蔗糖或甘油指示剂溴酚蓝）b. SDS-PAGE: 样品样品缓冲液（SDS，甘油，巯基乙醇，溴酚蓝），煮沸25min， 以除去亚稳态聚合。 3）加样及电泳：SDS-PAGE: 电极buffer中加0.1%SDS，溴酚蓝距下端1cm时停止电泳。,撬开短玻璃板,4）固定及染色 a.固定：将凝胶浸于7乙酸或12.5三氯乙 酸中固定蛋白质组分。 b.染色：考马斯亮蓝染色法银染法（灵敏度比前者高100倍）,等电聚焦 ( isoelectric focusing，IEF )利用蛋白质具有不同等电点的特性，以聚丙烯酰胺为电泳支持物，在其中加入载体两性电解质（商品名：Ampholine，一种含有各种连续 pI 的小分子混合物）的电泳方法称聚丙烯酰胺等电聚焦电泳（IEF-PAGE）。,
