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1、2018/10/20,1,检验系简介,2018/10/20,2,2018/10/20,3,谢国明检验系 临床检验仪器学教研室,紫外-可见分光光度计,2018/10/20,4,内 容1 光的吸收定律2 紫外-可见分光光度计的基本结构和工作原理； 影响分光光度法准确性的因素；紫外-可见分光光度计的类型。,2018/10/20,5,第一节、光的吸收定律,光吸收定律的表达式及其含义朗伯(Lambert) 于1760年阐明了光的吸收程度和吸收层厚度的关系：A b比耳(Beer)于1852年提出了光的吸收程度和吸收物浓度之间也具有类似的关系:A c二者的结合称为朗伯-比耳定律。,2018/10/20,6,
2、第一节、光的吸收定律,I0：入射光强度; C:溶液浓度(单位molL-1);b:液层厚度(通常以cm为单位)I:透射光强度;T:透光度 A:吸光度k:吸光系数(单位Lmol-1cm-1).,I0,I,2018/10/20,7,第一节、光的吸收定律,吸光度与透射率,C,2018/10/20,8,第一节、光的吸收定律,朗伯-比尔定律的适用条件：1.入射光为单色光；2.稀溶液。,但实际上难以获得真正意义上的纯单色光。分光光度计只能获得近乎单色的狭窄光普通带。复合光可导致对朗伯-比耳定律的正或负偏离。,假定只有在稀溶液(C 10-2 mol/L 时，吸光质点间可能发生缔合等相互作用，直接影响了对光的吸
3、收。 溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合物的形成等化学平衡时。使吸光质点的浓度发生变化，影响吸光度。,2018/10/20,9,第二节 紫外-可见分光光度计,分光光度计:能从含有各种波长的混合光中将每一单色光分离出来并测量其强度的仪器。 分析精密度高 测量范围广 分析速度快 样品用量少,2018/10/20,10,第二节 紫外-可见分光光度计,根据使用的波长范围不同分为紫外光区、可见光区、红外光区以及万用（全波段）分光光度计等。,2018/10/20,11,第二节 紫外-可见分光光度计,紫外-可见分光光度计：工作波段在200nm800nm的分光光度计。其中： 200nm400nm为紫外光区
4、。 400nm800nm为可见光区。 属于分子吸收光谱仪。,2018/10/20,12,第二节 紫外-可见分光光度计,分光光度计的实物图,2018/10/20,13,光源,单色器,吸收池,检测器,显示系统,一、紫外-可见分光光度计的基本结构和工作原理,紫外-可见分光光度计的基本结构示意图,2018/10/20,14,光源（light source）：提供入射光的装置。要求:1.能在所需波长范围的光谱区域内发射连续光谱；2.有足够的辐射强度并能长时间稳定。,一、紫外-可见分光光度计的基本结构和工作原理,常用类型：白炽光源与气体放电光源,2018/10/20,15,几种常见光源比较,一、紫外-可见
5、分光光度计的基本结构和工作原理,2018/10/20,16,单色器（Monochromator）：是将来自光源的复合光分解为单色光并分离出所需波段光束的装置。入射狭缝：限制杂散光进入； 色散元件：将复合光分解为单色光，有棱镜和光栅两种； 准直镜：将来自色散元件的平行光束聚集在出射狭缝上； 出射狭缝：将固定波长范围的光射出单色器，可以限制通带宽度。,一、紫外-可见分光光度计的基本结构和工作原理,2018/10/20,17,吸收池（absorption cell）：是用来盛放被测溶液的器件。在可见光区常用无色光学玻璃或塑料制作；在紫外区需用能透紫外线的石英或熔凝石英制作。 同一套吸收池的厚度、透光
6、面的透射、反射、折射应严格保持一致。指纹、油污及池壁上的沉淀物都会影响吸收池的透光性能。,一、紫外-可见分光光度计的基本结构和工作原理,2018/10/20,18,玻璃的透射性质,360 nm,2.25 mm,2018/10/20,19,200 nm,2.5 mm,石英,石英的透射性质,2018/10/20,20,通过改进吸收池的几何形状，可提高“光程/体积比”，即尽可能延长单位体积的光程。常用的有：微型吸收池（Microdrill absorption cell）：“光程/体积比”提高了近10倍。多光路吸收池（Multipie-path absorption cell）：在吸收池壁上装有反射
7、镜，使光线在溶液中经多次反射后才离开吸收池，大大增加了有效光程，提高了测定的灵敏度。,一、紫外-可见分光光度计的基本结构和工作原理,2018/10/20,21,检测器：把光信号转换为电信号的装置。 对检测器的要求：1.产生的电信号与照射到它上面的光强有恒定的函数关系；2.波长响应范围大；3.灵敏度高；4.响应速度快，一般要求小于10-8s；5.产生的电信号易于检测、放大，噪声低。,一、紫外-可见分光光度计的基本结构和工作原理,2018/10/20,22,2018/10/20,23,检测器工作原理,光照射在某些金属表面，会有光电子从金属表面逸出，这种光电效应称为外光电效应。利用外光电效应可以制成
8、光电管和光电倍增管。 光深入到物体内部，将物体内部原子中的一部分束缚电子激发成自由电子，但这些电子并不逸出物体，而是留在物体内部从而使物体导电性增强，称为内光电效应。利用内光电效应可制成光敏电阻、光敏二极管以及光电池。,一、紫外-可见分光光度计的基本结构和工作原理,2018/10/20,24,几种常用检测器比较,一、紫外-可见分光光度计的基本结构和工作原理,2018/10/20,25,信号显示系统:是把放大的信号以适当的方式显示或记录下来的装置。,一、紫外-可见分光光度计的基本结构和工作原理,2018/10/20,26,二、影响分光光度法准确性的因素,单色性不纯的影响杂散光的影响吸收池的影响电
9、压、检测器负高压波动的影响其它因素的影响,2018/10/20,27,（一）单色性不纯的影响 光的吸收定律只是在入射光为单色光的条件下成立，而通常所指的单色光是指有一定谱带宽度的光谱。由于单色器的类型和质量不同，得到的单色光纯度不同，加上使用中狭缝宽度调节不当，都可造成入射光的单色性不纯。从而使仪器读数不准，造成测量误差。,二、影响分光光度法准确性的因素,2018/10/20,28,（二）杂散光的影响： 有两种两种原因引起的杂散光：1. 仪器中光学、机械零件的反射和散射等原因使所采用的测定波长的光偏离正常光路，在不通过样品的情况下直接照射到单色器。这种杂散光波长与测定波长相同；2. 由仪器的光
10、学系统设计制作缺陷引起。如不必要的反射面、光束孔径不匹配、光学元件表面的擦痕、光学系统的像差、不均匀色散以及由于机械零部件加工不良、位置错移、仪器内壁防眩黑漆脱落等。,二、影响分光光度法准确性的因素,2018/10/20,29,（三）吸收池的影响 由于吸收池的质量不好或使用保管不善，吸收池不配套，透光面被污染上油污、指纹、沉淀，吸收池与光路不垂直等原因都可影响捡测结果的准确性。,二、影响分光光度法准确性的因素,2018/10/20,30,（四）电压、检测器负高压波动的影响 如果仪器电源电压波动过大，超过了仪器的稳压范围或稳压器质量不好，都可引起光源电压、检测器负高压波动，造成光源光强波动和检测
11、器噪声增大，使捡测结果准确度降低。,二、影响分光光度法准确性的因素,2018/10/20,31,（五）其它因素的影响 吸光度读数刻度误差、仪器安装环境（如振动、温度变化）、化学因素（如荧光、溶剂效应等）等也可影响捡测结果的准确度。,二、影响分光光度法准确性的因素,2018/10/20,32,三、紫外-可见分光光度计的类型,按其光学系统分可分为单波长分光光度计单光束单波长分光光度计双光束单波长分光光度计双波长分光光度计,2018/10/20,33,单波长单光束分光光度计特点单光束光路，从光源到试样至接收器只有一个光通道；仪器只有一个色散元件，工作波长范围较窄；通常采用直接接收放大显示的简单电子系
12、统，用电表或数字显示；结构简单、附件少、功能范围小，不能做特殊试样如浑浊样品、不透明样品等的测定。检测准确性不够稳定，不能用于精密分析。,三、紫外-可见分光光度计的类型,2018/10/20,34,单波长单光束分光光度计,三、紫外-可见分光光度计的类型,2018/10/20,35,单波长单光束分光光度计特点,2018/10/20,36,单波长双光束分光光度计 在出射狭缝和样品吸收池之间增加了一个光束分裂器或斩波器，用一定的频率将一个光束交替分成两路，使一路经过参比溶液，另一路经过样品溶液，然后由一个检测器交替接收或由两个匹配器分别接收两路信号。,三、紫外-可见分光光度计的类型,2018/10/
13、20,37,单波长双光束分光光度计特点 1.从光源到检测器有试样光路和参考光路两条通路； 2.采用两个光栅或棱镜加光栅的双单色器，能有效地提高分辨率和降低杂散光； 3.可以自动进行波长扫描、自动记录光谱曲线，也可以外接计算机，实现自动化运行； 4.可装备各种附件，功能范围宽。,三、紫外-可见分光光度计的类型,2018/10/20,38,单波长双光束分光光度计,三、紫外-可见分光光度计的类型,2018/10/20,39,单波长双光束分光光度计特点,2018/10/20,40,双波长分光光度计 双波长分光光度法的理论基础是差吸光度和等吸收波长。它采用了两个不同的波长即测量波长和参比波长同时测定一个
14、样品溶液。双波长分光光度计在测定时，两束不同波长的单色光经斩光器（Chopper）处理后，以一定的时间间隔交替照射比色杯，经待测溶液吸收后，再照到光电管上，产生两个不同的吸光度，再将这两个吸光度相减，就得到了差吸光度A。,三、紫外-可见分光光度计的类型,2018/10/20,41,双波长分光光度计,三、紫外-可见分光光度计的类型,2018/10/20,42,工作原理,A1=k1bC+Ap (1) A2 =k2bC+As (2)Ap、As分别为待测溶液在主波长和次波长处的散射或背景吸收当1 、2相差不太大时，由同一待测溶液产生的光散射吸光度和背景吸光度大致相等，即ApA s，将（1）式（2）式得
15、：A1A 2 A（k1k2）bC （3） 对于同一待测溶液来说，k1k2是一常数K，在光径L不变的情况下，（3）式可简化为： AKC （4）,2018/10/20,43,双波长分光光度计波长选择原则 1.被测物在一个波长上有最大吸收峰，在另一个波长上没有吸收或很少吸收； 2.非被测物在两个波长上的吸收相同。,三、紫外-可见分光光度计的类型,2018/10/20,44,双波长分光光度计优点,只要1、2选择适当，A就是消除了非特征性吸收干扰的吸光度值。将A用于计算结果能较好的解决由于非特征吸收信号（如试样的浑浊、吸收池与空气界面以及吸收池与溶液界面的折射差别等）影响而带来的误差，结果更准确。,三、紫外-可见分光光度计的类型,
