《活血化瘀汤对体外培养成骨细胞骨形成功能的影响》由会员分享，可在线阅读，更多相关《活血化瘀汤对体外培养成骨细胞骨形成功能的影响（22页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1活血化瘀汤对体外培养成骨细胞骨形成功能的影响活血化瘀汤对体外培养成骨细胞骨形成功能的影响专 业：中医骨伤专业研究生：曾勤导 师：张俐 副教授摘摘 要要目的：目的：观察中药活血化瘀汤对体外培养成骨细胞骨形成功能的影响，以探讨活血化瘀汤及活血化瘀法促进骨折愈合的作用机理。方法：方法：采用胰酶胶原酶消化法从新生 SD 大鼠颅骨获取成骨细胞，进行原代、传代培养，取第二代细胞经过鉴定后作为实验模型，将不同浓度的活血化瘀汤提取液和载药血清与分离培养制得的新生大鼠颅盖骨第二代成骨细胞共同培养。提取液直接刺激实验和载药血清实验均按照设计分别用 MTT 法观察对成骨细胞增殖功能的影响(用波长 490nm处 O
2、D 值表示)和氨基安替比林测酚法(金氏法)观察对成骨细胞分化功能的影响(用碱性磷酸酶活性表示)；提取液直接刺激实验用茜素红染色法(ARS 法)观察对成骨细胞矿化功能的影响(用每视野矿化结节数表示)。结果：结果：采用胰酶胶原酶消化法，进行体外细胞培养，可以获得比较纯化的成骨细胞。加药培养 3d 后测定细胞增殖结果显示：一定浓度的活血化瘀汤提取液和载药血清均能促进成骨细胞的增殖。其中提取液实验在 100-5000g/ml 浓度范围内的促进作用呈现剂量依赖方式，与对照组相比，100g/ml 和 500g/ml 药液即可促进成骨细胞增殖,但与对照组比较差异不显著(P0.05)，1000g/ml 和 5
3、000g/ml 药液与对照组比较均有显著性差异(P0.05)。结论：结论：活血化瘀汤促进体外培养成骨细胞早期的增殖与分化从而促进骨形成。促进成骨细胞的骨形成功能是活血化瘀汤及活血化瘀法促进骨折愈合的机理之一。实验结果提示我们在临床骨折的治疗方法上应该分期辨证，活血化瘀汤适用于骨折的早期。主题词：主题词： 活血祛瘀剂/药理学 细胞培养/方法 成骨细胞/药物作用 2骨折愈合/药物作用 大鼠 活血化瘀汤 Effects of Huo Xue Hua Yu (HXHY) Decoction to Bone Formation Function of Cultured Osteoblast in Vit
4、roMajor: Orthopedics and Traumatology of TCMPostgraduate: Zeng QinTutor: Prof. Zhang LiABSTRACTObjective: To observe the effects of Huo Xue Hua Yu(HXHY) decoction to bone formation function of cultured osteoblast which was from the skull of newborn SD rat in vitro, in order to explicate the mechanis
5、m by which HXHY decoction and HXHY method act on fracture healing.Methods: To obtain osteoblasts from neonatal SD rats skull adopting the method of Collagenasepancreatic enzyme digestion, conduct primary culture and sub-culturing，take the second generation cells as experimental model after identific
6、ation, and then respectively culture these cells with different concentrations of the HXHY extracted fluid and drug-containing serum fluid together. Both of two experiments took the same method as function of cell proliferation was measured by MTT method(OD value at wave-length 490nm)and function of
7、 cell differentiation was measured by Goldens method(ALP activity). Directly incentive experiment used alizarin red staining method to measure function of cell mineralization (mineralized nodes/field of vision).Results: Relatively rarefied osteoblasts could be obtained by means of cell culture in vi
8、tro using the method of Collagenasepancreatic enzyme digestion. Three days after communal cultivation, certain concentrations of HXHY extracted fluid and drug-containing serum could stimulate the proliferation of the OB2, and the former acted in dose-dependent manner in field of 100-5000g/ml. Contra
9、st with the control group, HXHY groups could promote the proliferation of the OB2 in the concentration of 100g/ml and 500g/ml whereas they had insignificant difference with control group(P0.05).1000g/ml and 5000g/ml groups had significant difference (P0.05).Conclusions：HXHY decoction can promote bon
10、e formation by accelerating the proliferation and the differentiation of osteoblast in vitro in early period. Promoting bone formation function of cultured osteoblast is one of the mechanism by which HXHY decoction and HXHY method effectively promote fracture healing. Results also suggest us that we
11、 should differentiate the symptoms and signs by stages while we treat the fracture clinically. HXHY decoction is fit for treating the fracture in early period. MeSH Term: Blood act stasis remove agent/pharmacologyCell culture/methodsOsteoblasts/drug effFracture healing/drug effRatsHuo Xue Hua Yu Dec
12、oction 4活血化瘀汤对体外培养成骨细胞骨形成功能的影响活血化瘀汤对体外培养成骨细胞骨形成功能的影响专 业：中医骨伤专业研究生：曾勤导 师：张俐 副教授前前 言言骨折愈合是一种特殊类型的创伤愈合反应，而成骨细胞在骨折愈合过程中对骨组织的损伤修复起关键作用。其合成和分泌 I 型胶原蛋白和多种非胶原蛋白，在全身和局部细胞因子调节下，能分泌类骨质和碱性磷酸酶等促矿化物质，从而促进新骨形成1。骨折愈合的关键依赖于成骨细胞的大量增加2。骨折愈合又是一个极其复杂的生物学修复过程，虽然大多数的骨折都能顺利愈合，但仍有 5%-10%的骨折发生延迟愈合或不愈合3。骨折不愈合的原因之一可能是骨折端渗出液中成骨
13、细胞生长活力降低所致4。因此，如何提高成骨细胞的功能，加速骨折的愈合，是骨科领域研究的重要课题之一。活血化瘀法是临床常用的骨折治疗方法。中国传统医学理论认为“血不活则瘀不能去，瘀不去则骨不能续”，“瘀去、新生、骨合”是一个连续的过程，这一观点已得到现代病理学观点的支持5。活血化瘀中药能加速骨折愈合也早已被实验和临床所证实。既往的研究显示活血化瘀法及中药促进骨折愈合的机理在于可以加快微循环血流速度,增加毛细血管网的通透性,清除血凝块，使断端产生良好血供，为骨折的愈合提供营养及清除代谢产物,从而加速骨折的愈合6、7、8。但是，其细胞学作用机制还有待于进一步研究。活血化瘀汤是林如高老先生的经验方，由
14、蒲黄、姜黄、当归、泽兰、茜草、三七、红花、莪术、生地、赤芍、紫苏、甘草等组成。方中蒲黄、姜黄、当归、泽兰、茜草、三七、红花、莪术活血通经，散瘀止痛；生地、赤芍清热凉血；“气行则血行”，故用紫苏、甘草行气宽中，以活络筋腱，消瘀退肿。福建省人民医院采用此协定处方广泛应用于治疗骨折疾患，取得了良好的临床治疗效果。其促进骨折愈合的确切作用机理值得探讨。中药促进骨折愈合的机理是一项极为复杂的过程,目前应用现代科学技术手段和方法阐明其机理是探讨中药促进骨折愈合的理想方法,特别是应用细胞生物学和分子生物学的方法,成为一种发展趋势9。在细胞和分子水平上来观察加速骨折愈合的研究,着重于作用机制的探讨,使临床药物
15、治疗成为促进骨折愈合的有效方法,应是目前主要研究的方向10。体外细胞培养是医学研究的重要手段，细胞组织培养技术已成为研究成骨细胞起源、形态、生化特性、分化发育及代谢调节等的重要工具。多年来，用于研究成骨细胞培养模型多5采用新生大鼠颅盖骨成骨细胞(23 代)，对体外培养成骨细胞的研究目前主要集中在活血祛瘀和补肾壮骨这两类骨科常用中药方面11，本研究通过体外培养观察活血化瘀汤对成骨细胞骨形成功能的影响，从细胞水平探讨活血化瘀汤及活血化瘀法促进骨折愈合的作用机理，丰富了活血化瘀法治疗骨折的理论依据，也为临床进一步开发活血化瘀类药物治疗骨折提供实验依据。材料与方法材料与方法1 1 实验动物实验动物1.
16、1 新生 1-2 日龄清洁级的 SD 大鼠 2 只，用于成骨细胞原代培养。由福建医科大学实验动物中心提供。实验动物合格证书号：医动字第 23-010(质)号。医学实验动物设施条件合格证号：闽实动条准第 200001 号。1.2 体重 32010g 雄性清洁级 SD 大鼠 20 只，用于制备含药血清。由中科院上海实验动物中心提供。实验动物合格证书号：SCXK(沪)20020010。医学实验动物设施条件合格证号：闽实动条准第 0113 号。2 2 实验药物实验药物 2.1 活血化瘀汤提取液的制备12：中药购自回春药店(附方：蒲黄 9g、姜黄 4.5g、当归 9g、泽兰 6g、茜草 9g、三七6g、红花 1.5g、莪术 6g、生地 9g、赤芍 9g、紫苏 9g、甘草 3g)，经过中药系蔡珍华老师鉴定，福建省第二人民医院制剂科加工。将上述各组方药物充分混合后，加水煎三次，纱布过滤。合并三次所得的滤液，
