混合饲料中各组分简介及其组分之间反应的可行性分析,制作人：miqimaike miqimaike@,制作内容,1、混合饲料的概念,2、挥发性盐基氮的产生机理,3、挥发性盐基氮的检测,4、残留物的检测,5、总结,1、挥发性盐基氮的概念,,,1.2,盐基氮的分类,挥发性盐基氮的概念,1.1 盐基氮的分类,,,,NH3,低级胺(MA、 DMA、TMA),高级胺,,挥发性盐基氮(total volatile basic nitrogen)物质，简称TVB-N它是指肉蛋白质在微生物的作用下发生分解产生氨、胺类碱性含氮物质，这类物质易和有机酸形成盐，具有挥发性，称这类物质为挥发性盐基氮物质1.2 挥发性盐基氮的概念,挥发性盐基氮是有毒物质肉中挥发性盐基氮物质含量的多少可以反应肉品质新鲜程度反映肉质变化情况和各个新鲜度间的差异，与感官变化情况较为一致因此，直接测定这些腐败产物就可作为判断食品质量的依据1.2 挥发性盐基氮的概念,2、挥发性盐基氮的产生机理,挥发性盐基氮的产生主要是氨基酸在微生物的作用下，发生了氧化脱氨基作用、水解脱氨基作用、还原脱氨基作用以及脱羧基作用从而生成了NH3·H2O、低级胺。
甲胺 二甲胺 三甲胺 三种主要的低级胺,2、挥发性盐基氮的产生机理,机理如下,氧化脱氨基作用,水解脱氨基作用,还原脱氨基作用,脱羧基作用,,,微生物作用下,+,+,+,+,,微生物作用下,NH3,NH3,NH3,CO2,R、R’中的C≥0，H、CH3、C2H5等,,挥发性盐基氮,,3、挥发性盐基氮的检测,,,,,,,,,挥发性盐 基氮的 检测,3.1、挥发性盐基氮的检测方法,3.2、半微量凯氏定氮法,3.4、近红外光谱法,3.3、微量扩散法,3、挥发性盐基氮的检测,检测方法参照 GB/T5009.44-2003《肉与肉制品卫生标准的分析方法》，,肉中含有大量的蛋白质，在贮藏过程中由于微生物和酶的作用，蛋白质分解生成碱性含氮物质，例如氨、伯胺、仲胺以及叔胺等，这些物质都具有挥发性在碱性条件下，这些含氮物质可以与水蒸气一起蒸馏出来因此，通过测定挥发性盐基氮（TVB-N）的含量可以评价肉的新鲜度3.1 挥发性盐基氮的检测方法,,目前检测挥发性盐基氮含量的方法有：,3.2、半微量凯氏定氮法,挥发:挥发性含氮物质加热可在碱性溶液中释放出（采用氧化镁的悬浊液）吸收：挥发后吸收于硼酸吸收液中2NH3 + 4H3BO3→(NH4)2B4O7 + 5H2O滴定：生成的硼酸铵用标准酸滴定，计算含量。
(NH4)2B4O7 + 2HCl + 5H2O →2 NH4Cl + 4H3BO4反应物质量对应关系： NH3→HCl,3.2.1 原理,向接收瓶内加入硼酸及混合指示剂(甲基红、次甲基蓝)，并使冷凝管下端插入液面下蒸馏水中加入甲基橙指示剂数滴，再加入稀硫酸，使溶液保持橙红色 取样品液注入凯氏定氮仪的反应管中，用蒸馏水冲洗进样入口，再加氧化镁悬液塞好入口玻璃塞，用少量蒸馏水冲洗进样入口，且在入口处加水封好，防止漏气打开水蒸汽发生器与反应室之间的夹子，蒸汽通入反应室，徐徐蒸馏，使氨气被蒸发出来，并通过冷凝管而进入接收瓶内，以第一滴馏液滴下开始计时，蒸馏5min，停止蒸馏结束：取下接收瓶，松开水蒸汽发生器瓶上的夹子，迅速夹紧水蒸汽发生器和反应室之间的夹子，将废液排出用蒸馏水将冷凝管和接收管洗涤，合并入吸收液3.2、半微量凯氏定氮法,3.2.2 流程,3.2、半微量凯氏定氮法,微量凯氏定氮蒸馏装置,3.2、半微量凯氏定氮法,3.2.3 注意事项,1．蒸馏时，蒸汽发生要均匀充足，蒸馏中途不得停火断汽，否则发生倒吸2. 加碱要足量（反应室液体呈深蓝色或褐色）并且碱液不能污染冷凝管及接收瓶。
3. 蒸馏水应保持酸性，防止水中的游离氨被蒸出而使结果偏高 4. 蒸馏是否完全，可用精密pH试纸测试冷凝管出口的冷凝液是否呈碱性来确定3.2、半微量凯氏定氮法,UDK142凯氏定氮仪,将有机化合物与硫酸共热使其中的氮转化为硫酸铵在这一步中，经常会向混合物中加入硫酸钾来提高中间产物的沸点样本的分析过程的终点很好判断，因为这时混合物会变得无色且透明（开始时很暗）在得到的溶液中加入少量氢氧化钠，然后蒸馏这一步会将铵盐转化成氨而总氨量（由样本的含氮量直接决定）会由反滴定法确定：冷凝管的末端会浸在硼酸溶液中氨会和酸反应，而过量的酸则会在甲基橙的指示下用碳酸钠滴定所得的结果乘以特定的转换因子就可以得到结果凯氏定氮仪原理,挥发:挥发性含氮物质在37℃可在碱性溶液中释放出吸收：挥发后吸收于硼酸吸收液中2NH3 + 4H3BO3→(NH4)2B4O7 + 5H2O滴定：生成的硼酸铵用标准酸滴定，计算含量 (NH4)2B4O7 + 2HCl + 5H2O →2 NH4Cl + 4H3BO4反应物质量对应关系： NH3→HCl,3.3 微量扩散法,3.3.1 原理,3.3 微量扩散法,3.3.2 流程,1、加样: 将水溶性胶涂于扩散皿的边缘，在皿中央内室加入硼酸吸收液及混合指示液，溶液呈红紫色。
在皿外室一侧加入样液，另一侧加入饱和碳酸钾溶液，注意勿使两液接触，立即盖好.,3、滴定： 揭去盖，用盐酸或硫酸标准滴定液(0.100mol/L)滴定内室的吸收液，终点至蓝紫色，同时做试剂空白试验,2、 反应: 用毛玻璃密封后，将皿于桌面上轻轻转动，使样液与碳酸钾溶液混合，然后于37℃温箱内放置2h溶液呈绿色3.3 微量扩散法,外室,内室,康威氏微量扩散皿（标准型）,3.3 微量扩散法,3. 反应温度应该保持在37℃，温度过高会使蛋白质分解，导致结果偏高3.3.3 注意事项,1. 在康威氏皿的外室，样液和饱和碳酸钾溶液在密封前绝对不能混合，防止生成的氨挥发密封后，将皿在桌上轻轻转动，应注意不要使外室的溶液进入内室2. 康威氏皿一定要保证密封这两种方法存在缺陷1、如含氮物质扩散速度慢而耗时长且操作繁琐冗长、氧化镁混悬液易产生沉淀而难以保证吸取浓度一致，2、其颗粒易堵塞移液管，使得蒸馏效果不稳定，而反应室内样品液因加热而剧烈沸腾，3、氧化镁混悬液泡沫污染反应器顶部且难以清洗，易回流至冷凝管使蒸馏失败3.4、近红外光谱法,近红外光(near-infrared, NIR)是介于可见光与中红外光间、波长为 780-2526 nm 的电磁波。
近红外光技术利用物质在近红外光谱区中所显示的光谱特性进行快速、高效、无损地定性判别或定量分析检测，从而推断样品成分物质种类或含量随着化学计量学方法在光谱信息提取及消除噪音、背景干扰等方面地发展，测量时的数字信息化、分析检测时的绿色环保化使该光谱学测量技术与化学计量学有机结合而广泛应用到食品、农牧业、医药、石油等行业中3.4、近红外光谱法,近红外光谱技术分析特点(1) 测量速度快、分析效率高，光谱信息快速通过近红外光谱仪后，在计算机中已建校正模型对被测样组分含量或性质进行数据处理和统计分析而获得定量定性结果； (2) 不损伤破坏样品，近红外光谱区域倍频或合频吸收系数小，光散射效应和穿透度大，无需对被测样预处理即可通过透射、漫反射技术测定； (3) 适用检测样品范围广，利用相应测样器件可方便易行地测定液体、固体、半固体和胶状体等不同物理状态样品光谱； (4) 无环境污染，获得透射或漫反射光谱信息时无需改变被测样状态或使用化学试剂，因而对样品和环境不会造成污染，绿色环保； (5) 光谱测试重现性好，结果稳定较少受到外界主观因素影响，具有较好重现性； (6) 可实现光谱分析和利用光纤传导实现远距离或恶劣环境中样品测量。
3.4、近红外光谱法,此部分由于现有的资源有限，没有找到相关的文献及类似的测试方法，所以在此部分的制作主要结合了专业上的相关知识以及个人的思路、想法以肉类为例，进行陈述,4、未挥发的残留物的检测,其中由于自身知识面有限，必然会存在一些想法和思路不恰当的地方，还请见谅4.1 仪器,,,4.2 实验 步骤,4.3 小结,4、未挥发的残留物的检测,1、凯氏定氮仪/元素分析仪用途：测定氮含量一般蛋白质中的氮含量平均为16%(质量分数)2、液相色谱仪/气相色谱仪/TLC硅胶板（柱）用途：测定难挥发成分中每个成分的比例如果难挥发成分中的组分很多，建议不适用TLC硅胶板（柱）,3、质谱仪/凝胶渗透色谱仪/核磁共振波谱仪用途：测定分子量如果分子量过大（>1000）,可以使用凝胶渗透色谱仪核磁共振波谱仪不但可以间接计算出分子量也可以得到有机分子的结构4、傅里叶变换红外光谱仪用途：观察官能团，看看有没有C-N、N-H的特征吸收峰4.1、仪器,,液质、气质联用最佳,4.2、实验步骤,4.2.1、蛋白质中的氮元素转移路线,残留物（C）,,蛋白质中的氮,,,挥发性盐基氮 (A),,上述测试方 法的到氮含量,,未发生腐败 的蛋白质 (B),,A,B,,凯氏定氮仪 测试氮含量,,C,蛋白质中的氮元素转移路线图,,凯氏定氮仪 测试氮含量,,,,,,计算相对应的,蛋白质含量,蛋白质中的含氮量平均为16%（质量分数）,,4.2、实验步骤,,反应管内 的残夜,,过滤,除去 氧化镁,,减压蒸馏 除去水,混合物 （X）,,红外测试,,存在C-N、N-H 的特征吸收峰,凯氏定氮仪 测试氮含量,,,,推算出相应 蛋白质的质量,假设混合物内不含有 其他无机盐等杂质,,,,如果含有无机盐 等杂质，应该先 对其经行萃取除 去无机盐。
真空 烘干,做液质,,,通过液相部分可知道含有几种 成分，以及每个成分的含量,在质谱可知道每种成分的分子量,4.2.2、残留物的分析测试线路图,,通过每个成分的含量，可以推出 此类成分相对应的蛋白质的质量,4.2、实验步骤,补充,1、如果没有液质联用，只有液相色谱仪（制备型） 取一定量的混合物做液相，可得到每种成分的含量，既可以推算出混合物中各种成分的含量将液相色谱制备出的每种成分，烘干，采用核磁共振波谱仪测试其分子结构，进而推出其分子量2、如果没有液相色谱仪，可以采用传统的TCL薄层色谱法此法工作量大，繁琐只能用于定性分析使用，不能准确计算各种成分的含量同时一定要具有一种准确的分子结构分析工具，如质谱仪或核磁共振波谱仪等3、不建议使用气相色谱，因为气相温度过高，有可能使混合物的成分分解，使结果不准确备注：对于分子量过高的物质，采用质谱仪和核磁共振波谱仪是测试不分子量，所以一般对于分子量很高的物质采用凝胶渗透色谱仪1、本文简单的对挥发性盐基氮的测试方法进行了概述，并对残留物提出了个人的分析方法3、由于时间仓促未对挥发性盐基氮的测试方法进行较详细的了解，因此在概述上会存在许多不恰当的地方。
4、首次接触挥发性盐基氮，必然会存在很多理解上的问题和错误，请给位专家指导5、总结,2、对于近红外方法测试含氮量了解的不够详细，还需要进一步学习。