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1、反义核酸抗病毒药物在兽医临床 的应用与研究(禽病篇),韩健葆 博士 15950555896 南京农业大学动物科技学院 楠森兽医诊断技术研究中心,家禽病毒感染控制与净化方案的创造,关于病毒,病毒是一类超显微的、不具有细胞结构的、专性活细胞内寄生的实体。它由一种核酸(DNA或RNA)和蛋白质组成,没有酶或酶系统极不完全,不能进行独立的代谢作用,必须寄生在宿主细胞内,借助于宿主细胞的代谢系统复制自身的核酸和蛋白质才能繁殖。,病毒的感染机制,病毒的生活史分为5个基本过程： 吸附(absorption)：病毒对细胞的感染起始于病毒蛋白外壳同宿主细胞表面特殊的受体结合，受体分子是宿主细胞膜或细胞壁的正常成
2、分。因此，病毒的感染具有特异性。 侵入(penetration)：病毒吸附到宿主细胞表面之后，将它的核酸注入到宿主细胞内。 复制(replication)：病毒核酸进入细胞后有两种去向，一是病毒的遗传物质整合到宿主的基因组中，形成溶原性病毒；第二种情况是病毒DNA(或RNA)利用宿主的酶系进行复制和表达。 成熟(maturation)：一旦病毒的基因进行表达就可合成病毒装配所需的外壳蛋白，并将病毒的遗传物质包裹起来，形成成熟的病毒颗粒。 释放(release)：病毒颗粒装配之后，它们就可从被感染的细胞中释放出来进入细胞外，并感染新的细胞。有些病毒释放时要将被感染的细胞裂解，有些则是通过分泌的方
3、式进入到细胞外。,病毒性传染病在养禽业中所扮演的角色,在临床流行性的疾病所导致的损失中,约有70%疾病损失是由病毒性疾病导致,所以病毒性疾病是影响养殖业健康发展和盈利的关键因素。,危害养殖业较大的病毒分类,YebatonTM的研发背景,近年来,由于从国外引种及进口动物源性饲料原料，饲养管理模式的改变等导致病毒性疾病发生和控制愈渐复杂,养殖场普遍面临着新增的病毒性疾病与老病新发的病毒性疾病双重夹击的困扰，造成生产上极大的损失，对养殖业的健康发展形成了巨大的障碍。 但就目前的抗病毒药物的品种结构而言,可供临床使用的药物比较有限,远不能满足生产上预防和治疗病毒病的需要。寻找新的有效的抗病毒药,特别是
4、对病毒具有高度选择性、而对宿主细胞无毒害的药物仍是当前迫切的需要。在这种特殊时期，yebatonTM应时而生，将会给中国乃至世界的养殖场所遭受的病毒感染带来新的控制方案。 SENNAN BIO. 下属的中国新药研发中心（NDDC）与美国Cornell University基因工程药物研究中心技术合作，将反义技术和反义寡核苷酸药物（yebatonTM）这一全新的“沉默基因”治疗技术引用到兽医临床，为当前愈见复杂的病毒性疾病的药物有效控制提供了新的途径。,有了疫百特TM，我们才能与病毒和谐共处,SENNAN BIO. 针对猪、家禽和虾的主要传染病设计合成的yebatonTM（反义脱氧寡核苷酸），具
5、有较强的抗病毒活性。体外实验表明本品对猪的（猪瘟病毒、蓝耳病病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病毒、圆环病毒）；禽的（流感病毒、新城疫病毒、传支病毒、鸭肝炎病毒、法氏囊病毒）；对虾的（白斑综合征（WSS）病毒和桃拉综合征（TS） 病毒）显示出极强的抗病毒作用。目前在兽医临床上尚无任何抗病毒化合物被许可使用，yebatonTM对于DNA病毒和小RNA病毒的控治以其良好的药代动力学特征、广谱的抗病毒作用、广泛的临床适应症以及良好的耐受性和无毒副作用的特点,将会为养殖业的健康发展和畜禽病毒性疾病的控治做出重要的贡献。,YebatonTM是指建立在反义技术（Antisense technology）的基础上，采
6、用人工合成的反义脱氧寡核苷酸经特殊工艺修饰制备的基因工程抗病毒免疫增强新药，这种基因片段药物（DNA及RNA片段）是与病毒DNA或RNA互补的核酸序列,能与病毒基因链的保守核苷酸序列（即mRNA ）杂交,形成稳定的互补结构,选择性地干扰或封闭基因表达、阻断病毒基因正常复制，以达到治疗病毒病目的的新型治疗技术，被称之为“沉默基因”或“生物导弹”给药技术。,什么是 YebatonTM,YebatonTM的特点,相对广谱性（针对危害家禽主要病毒设计的反义脱氧寡核苷肽） 高效性（病毒性疾病良好的控制效果） 最优化的药物设计（可以和任何化学药物及中药混合复配） 长期投药无毒，安全。 针对病毒目的基因作用
7、，不产生耐药性。,YebatonTM的空间结构,YebatonTM所独特的拟病毒结构，进入机体后可被免疫系统误认为是遭受到病毒攻击从而激活机体的特异性和非特异性的免疫防卫机能。,神奇的 拟病毒结构,YebatonTM的结构特点,我们采用低聚壳聚糖对寡核苷酸基因修饰技术将经修饰的反义寡核苷肽制备成速溶缓释颗粒，家禽口服YebatonTM后，经过消化道逐步吸收有效成分（反义脱氧寡核苷酸），保证绝大多数有效药物核酸分子的生物活性不被破坏，具备高水平的生物利用率，这种壳聚糖修饰技术和缓释制剂工艺是保证生物活性药物经家禽口服后不被消化道内酶破坏的理想技术。,以壳聚糖为载体的口服基因药物 唐明青1,刁 勇
8、1,2,许瑞安1,2 (1.华侨大学分子药物学研究所, 2.分子药物教育部工程研究中心,福建泉州362021),摘 要:口服给药由于服用方便、病人依从性好、治疗费用低等优势一直是研究的热点。基因药物临床试验 的成功再次激起了人们对基因药物口服给药的研究热情。以壳聚糖为载体的口服基因药物临床前研究已取得长足进展,但要成功地应用于临床,尚需对水溶性、胃肠道稳定性、膜通透性、转染效率等关键问题进行深入研究。Oral gene medicines mediated by chitosan TANGMing-qing1, DIAOYong1,2, XURui-an1,2 (1.Institute ofM
9、olecularMedicine, Huaqiao University,2.MolecularMedicine Engineering Research Center,Ministry ofEducation, Quanzhou362021, China),口服给药由于服用方便、病人依从性好、治疗费用低等优势,成为最常见的给药途径。但长期以来,基因药物的给药以注射途径为主,是因为口服给药存在多种限制因素,如胃中的低pH可使DNA脱嘌呤化,消化酶易降解治疗基因,常用基因载体难以被肠上皮细胞摄取等,相关释药技术的发展明显滞后于基因药物本身的发展。作为一种天然的阳离子聚合物,壳聚糖不仅易与带负电荷
10、的DNA等遗传物质结合而形成纳米微粒,还具有无毒、易获得、生物可降解、稳定、生物相容、能抵抗胃肠道环境(pH、核酸酶)对药物的破坏、生物黏附性强、可促进药物渗透吸收等优点,日益成为口服基因药物的优良载体。,yebatonTM （多聚-反义寡核苷酸肽）经口服进入体内后与特异宿主细胞结合，在酶的催化作用下脱去肽骨架，导入细胞内，识别并激活2、5-寡腺苷酸合成酶，被活化的寡腺甘酸可以使潜伏在体内的内源核酸酶（核酸内切酶-Dicer）活化，在RNA诱导的基因沉默复合体（RISC，RNA-induced silencing complex） 作用下，对（病毒）靶基因mRNA进行切割，引起病毒复制环节能力
11、丧失，从而达到抗病毒的作用。,yebatonTM的作用机制(抗病毒机理),yebatonTM的作用机制(免疫调节机理),yebatonTM所独特的拟病毒结构，进入机体后可被免疫系统误认为是遭受到病毒攻击从而激活机体的特异性和非特异性的免疫防卫机能。对其免疫调节抗肿瘤机制的研究表明，其主要作用是激活自然杀伤细胞（NK细胞）、T、B淋巴细胞、巨噬细胞活性、诱导机体产生多种干扰素、多种细胞介素，从而达到预防和治疗病毒病，修复机体免疫缺陷的作用。,YebatonTM实验室与临床研究,森楠生物新药研发中心的研究人员在长达六年的实验室研究和众多猪、禽场进行临床应用性研究，结果表明：疫百特(YebatonT
12、M)对猪、禽临床常见多种病毒性疾病具有很好的预防和理想、经济的治疗效果。,YebatonTM抑制新城疫病毒（NDV）感染细胞的试验,结果显示：YebatonTM对NDV在细胞内感染有明显的抑制作用。对照（Control）组的细胞中形成的平均空斑数为128个。 YebatonTM组的细胞中形成的平均空斑数为27个。,将CEF细胞培养成单层，YebatonTM转染；以生理盐水作对照。24 h后接种新城 疫病毒（NDV）。病毒感染72h后通过病毒空斑测定评价YebatonTM对病毒复制 的抑制效果。 空斑试验：收集待检测细胞和上清，经反复冻融3次后各吸取100L，用MEM 做10倍梯度稀释后，分别接
13、种于已长成单层的CEF细胞上,吸附1h，吸弃病毒 液，加入2mL琼脂糖覆盖液，37继续培养，待出现明显病变形成空斑后，用 1：1000稀释的中性红染色1 h，弃去中性红染色液，数空斑数目，利用t检验 对数据进行显著性分析 。,YebatonTM与常用化学抗病毒药物的治疗对比,YebatonTM对人工感染新城疫、法氏囊、传染性支气管炎病毒后的发病率影响,结果表明:在适当的剂量范围内，YebatonTM的添加量越大，控制病毒感染的效果越显著。,YebatonTM不同剂量饮水添加后对各病毒攻毒后的保护情况,YebatonTM抑制流感病毒（AIV）感染细胞的试验,将CEF细胞培养成单层，Yebaton
14、TM转染;以PBS液作对照.14 h后再接种AIV。病毒感染48 h后通过间接免疫荧光评价YebatonTM对病毒复制的抑制效果。,图1. 未用YebatonTM转染的感染AIV的CEF细胞（100）,图2. 用YebatonTM转染的感染AIV的CEF细胞（100）,结果表明，转染YebatonTM可以显著的抑制病毒对细胞的感染。,禽场实施病毒性传染病良好控制的原则,禽场实施病毒性传染病良好控制的原则,系统的免疫检测,定期的有效药物 保健（YebatonTM）,科学的疫苗接种程序,三位一体,只有尽快实施“三位一体”的健康管理模式（系统的免疫检测、科学的疫苗接种程序、定期的有效产品保健），才是
15、禽场重大疾病控制或清除计划的最佳手段！,“三位一体”的健康管理模式,解除免疫抑制、改善免疫状态、弥补免疫遗漏、减轻病毒感染压力、结合免疫程序使用，提升灭活疫苗及活疫苗免疫效果的完美方案！,yebatonTM做为免疫佐剂提高疫苗免疫效果,yebatonTM抗病毒又为何提高活疫苗免疫效果？,活病毒感染的第一个阶段是在机体的淋巴系统（在淋巴系统完成细胞免疫应答）。弱毒苗是人工致弱的病毒，正常情况下在机体淋巴系统完成细胞免疫应答后，致弱活病毒都会被抗原递成系统转化成抗体，即使有少量的弱毒在淋巴系统增殖后逃逸到血液循环系统并出现一过性的轻微临床症状（轻微的病毒血症）也会很快的被血液系统里存在的特异性抗体
16、；巨噬细胞、NK杀伤细胞等构成非特异免疫系统细胞所控制住。而野毒（非致弱活病毒）往往会在淋巴系统内大量的增殖并涌入血液循环系统，并随着血液循环直接进入实质性脏器（如肺脏、肾脏、肝脏、脾脏等）并将这些脏器上的特定健康细胞作为第二宿主细胞而进行再次的破坏，导致脏器的坏死、出血等病变从而引起脏器的代谢功能紊乱等一系列临床表现从而发病甚至死亡。yebatonTM抗病毒是发生在血液循环系统，主要在受病毒感染的宿主细胞内阻断病毒基因表达复制从而达到抗病毒目的。而对存在淋巴系统的病毒（弱毒或野毒）作用不到，所以不会影响弱毒疫苗所诱导的细胞免疫应答过程。,影响禽群免疫效果的主要因素,病毒性传染病的控制，一直以
17、来都是依赖疫苗的免疫接种，不可否认，对于传染病的控制，疫苗的免疫接种是最基础的、最经济的、最主动的措施，但是面对当前畜禽传染病的发生现状，仅仅依赖疫苗的免疫接种来控制传染病已明显感到不足。 免疫受体（禽群）的免疫状态（如:免疫抑制、免疫麻痹、免疫缺陷、免疫遗漏）。这种现象通过疫苗（特异性抗原）是消除或缓解不了的，必须要通过非特异性免疫增强剂参与抗原协同工作，先将免疫受体的免疫状态调节正常，这样机体免疫系统才能对抗原产生正常的免疫应答。 野毒的免疫干扰和免疫占位现象我国鸡场的新城疫为什么总是防不好？追究其根本原因就是鸡群普遍遭受野毒持续侵染导致带毒密度过大，与疫苗弱毒竞争宿主细胞后致使免疫状态不稳定。,
