食品微生物检验：食品卫生细菌检验

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1、食品卫生细菌检验,食品微生物检验,第一节 菌落总数的测定,一、菌落总数与食品卫生质量 目的：了解食品在生产中，从原料加工到成品包装受外界污染的情况；也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，确定食品的保存期，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。,菌落总数的几个概念,菌落总数：Aerobic Plate Count，食品检样经过处理，在一定条件下培养后（如培基、温度、时间、pH、需氧性质等）所得1mL（g）检样中形成微生物菌落的总数。只包括一群在平板计数琼脂上生长发育的嗜中温需氧或兼性厌氧菌的菌落总数。菌落总数不等于细菌总数。 菌落：Colony，单个微生物在适宜固体培养基表面或内部生长

2、繁殖到一定程度，形成肉眼可见有一定细菌群落。 CFU: Colony Forming Units，菌落形成单位。,意义：食品中菌落总数的多少，直接反映着食品的卫生质量。是判断食品卫生质量的重要依据之一 。 （1）可以反应食品的新鲜度。 （2）可以反应食品被细菌污染的程度。 （3）生产过程中食品是否变质。 （4）食品生产的一般卫生状况等。,如果食品中菌落总数多于10万个，就足以引起细菌性食物中毒；如果人的感官能察觉食品因细菌的繁殖而发生变质时，细菌数大约已达到106-107 CFU/g (mL或cm2)。,一般而言，食品的变质反映与菌落总数的增多有一定联系，但有时食品中细菌含量很高，即使已达到相

3、当于同种食品已变质时的细菌数，而食品并未有任何变质现象；有时食品遭受污染的程度特别严重，食品中虽含有大量的细菌，由于时间短暂或细菌繁殖条件不具备，就见不到变质现象。 例如：细菌难以生长的一些干制食品和冰冻食品，它们含有细菌的多少，就可以表明这些食品在生产、运输、贮藏等过程中卫生管理的状况。,另外还有发现在检出菌落总数在5000个/g以下的样品中，和其中仅含菌落总数380个/g的样品中，均可分离出沙门氏菌，并且都有大肠菌群存在。 在一些菌落总数低的食品中(如罐头食品)，曾有细菌繁殖并已产生了毒素，但是由于环境条件的限制使细菌不能延续生长繁殖，而毒素因性状稳定不受环境的影响而仍在食品中保留。 像这

4、种情况，就不能单凭菌落总数一项指标来评定食品卫生质量的优劣。,根据以上事实，食品中菌落总数的测定对评定食品的新鲜度和卫生质量起着一定的卫生指标作用，但还必须配合大肠菌群的检验和病原菌项目的检验，才能作出比较全面准确评定。,说明： 国家标准中采用的培养方法是样品处理后倾注平板，36，培养482小时实际测定的是嗜中温好氧菌的菌落总数。 菌落总数测定是对细菌的无差别培养，不能区分细菌种类，所以有时被称为杂菌数。,二、菌落总数的测定方法 GB/T 4789.2-2010 数据记录,4 培养基和试剂4.1 平板计数琼脂培养基（A1） 4.2 磷酸盐缓冲溶液 （A2） 4.3 无菌生理盐水 （A3）,4

5、培养基和试剂4.1 平板计数琼脂培养基 （A1） 4.2 磷酸盐缓冲溶液 （A2） 4.3 无菌生理盐水 （A3）,4 培养基和试剂4.1 平板计数琼脂培养基 （A1） 4.2 磷酸盐缓冲溶液 （A2） 4.3 无菌生理盐水 （A3）,6 操作步骤,6.1 样品的稀释 6.1.1 固体和半固体样品：称取25 g 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000 r/min10000 r/min 均质1 min2 min，或放入盛有225 mL 稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min2 min，制成1:10 的样品匀液。 6.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25

6、 mL 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。,6.1.3 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。 6.1.4 按6.1.3 操作程序，制备10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1 次1 mL 无菌吸管或吸头。 6.1.5 根据对样品污染状况的估计，选择2 个3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），

7、在进行10 倍递增稀释时，吸取1 mL 样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1 mL 空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。 6.1.6 及时将15 mL20 mL 冷却至46 的平板计数琼脂培养基（可放置于46 1 恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。,6.2 培养 6.2.1 待琼脂凝固后，将平板翻转，36 1 培养48 h2 h。水产品30 1 培养72h3 h。 6.2.2 如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4 mL），凝固后翻转平板，按6.2.1 条件进行培养。,6.3 菌落计数可用

8、肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units，CFU）表示。 6.3.1 选取菌落数在30 CFU300 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30 CFU 的平板记录具体菌落数，大于300 CFU 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。,6.3.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。 6.3.3 当平板上出现

9、菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。,7 结果与报告,7.1 菌落总数的计算方法 7.1.1 若只有一个稀释度平板在30-300CFU，则计算两平行平板的均数，再乘以稀释倍数报告之 7.1.2 若有连续两个稀释度符合计数要求则按下公式,例1：10-2=232，24410-3=33，35 例2：10-1= 232，24410-2=33，29,菌落总数,所有符合计数要求的平板菌落数之和,较低稀释度有效平板数,较高稀释度有效平板数,较低稀释度的稀释倍数,N=(232+244+33+35)(2+20.1）10-1 =544/0.022 =24727,上述数据按7.2.2数字修约

10、后，表示为25000或2.5104,7.1.3 若所有稀释度的平板上菌落数均大于300 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。 7.1.4 若所有稀释度的平板菌落数均小于30 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。 7.1.5 若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1 乘以最低稀释倍数计算。 7.1.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在30 CFU300 CFU 之间，其中一部分小于30 CFU 或大于300CFU 时，则以最接近30 CFU 或300 CFU 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。,7.

11、2 菌落总数的报告,7.2.1 菌落数小于100 CFU 时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。 7.2.2 菌落数大于或等于100 CFU 时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0 代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。 7.2.3 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。 7.2.4 若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。 7.2.5 称重取样以CFU/g 为单位报告，体积取样以CFU/mL 为单位报告。,菌落总数检验操作流程图,若样品中可能含有表面蔓延生长的菌落时，可在培基凝固后再覆盖一薄层培养基 水产

12、品置于30 1 培养72h 3h。,新计数公式的统计学依据,平板菌落数越多，结果越具有代表性（不考虑稀释倍数和培养基的营养状况等） 取样量越大，结果越具有代表性（同等取样条件、排除其他方面的干扰因素） 不同的取样量赋予不同的权重，而不是简单的取平均值。 新旧方法计算同一结果会有所不同,结果表述,第二节 食品中大肠菌群的测定,一、大肠菌群的定义及范围 大肠菌群(coliform bacteria)系一群在37，24h能发酵乳糖，产酸、产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。 大肠菌群主要是由肠杆菌科（Enterobacteriaceae）中四个菌属内的一些细菌所组成，即埃希氏菌属（Esche

13、richia）、柠檬酸杆菌属（Citrobacter）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）及肠杆菌属（Enterobacter）。,大肠菌群中大肠埃希氏菌I型和型的特点是，对靛基质、甲基红、V-P和枸橼酸盐利用四个生化反应分别为“+-”，通常称为典型大肠杆菌； 而其他类大肠杆菌则被称为非典型大肠杆菌。,产气克雷白氏菌,大肠杆菌是人和温血动物肠道内普遍存在的细菌，是粪便中的主要菌种。一般生活在人大肠中并不致病，但它侵入人体一些部位时，可引起感染 。,大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血

14、清学方面并非完全一致。一般认为可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、克雷白氏菌和肠杆菌等。,总大肠菌群系指一群在37培养24小时能发酵乳酸、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。,耐热大肠菌群即粪大肠菌群，作为一种卫生指标菌，耐热大肠菌群中很可能含有粪源微生物，因此耐热大肠菌群的存在表明可能受到了粪便污染，可能存在大肠杆菌。但是，耐热大肠菌群的存在并不代表对人有什么直接的危害。,致病性大肠杆菌能引起食物中毒。致病性菌株能侵入肠粘膜上皮细胞，具有痢疾杆菌样致病力。肠致病性大肠杆菌（EPEC）、肠毒素性大肠杆菌（ETEC）和肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）等。,O157:H7（EHEC) 肠出血性

15、大肠杆菌，感染性腹泻是近年来新发现的危害严重的肠道传染病，已逐渐成为威胁人群健康的重要公共卫生问题。,大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌的从属关系,二、大肠菌群的测定意义 1. 粪便污染的指标细菌 早在1892年，沙尔丁格首先提出大肠杆菌作为水源中病原菌污染的指标菌的意见，因为大肠杆菌是存在于人和动物的肠道内的常见细菌。 一年后，塞乌博耳德史密斯指出，大肠杆菌因普遍存在于肠道内，若在肠道以外的环境中发现，就可以认为这是由于人或动物的粪便污染造成的，从此，就开始应用大肠杆菌作为水源中粪便污染的指标菌。,据研究发现，成人粪便中的大肠菌群的含量为：108109个/g。若水中或食品中发现有大肠菌群，即可证

16、实已被粪便污染，有粪便污染也就有可能有肠道病原菌存在。 根据这个理由，就可以认为这种含有大肠菌群的水或食品供食用是不安全的。 所以目前为评定食品的卫生质量而进行检验时，也都采用大肠菌群或大肠杆菌作为粪便污染的指标细菌。,2粪便污染指标菌的选择 作为理想的粪便污染的指标菌应具备以下几个特性，才能起到比较正确的指标作用。 存在于肠道内特有的细菌，才能显示出指标的特异性。 在肠道内占有极高的数量，即使被高度稀释后，也能被检出。 在肠道以外的环境中，其抵抗力大于肠道致病菌或相似，进入水中不再繁殖。 检验方法简便，易于检出和计数。,一般认为大肠菌群都直接或间接来自于人或温血动物的粪便。 粪便中数量最多的是大肠菌群，而且大肠菌群随粪便排出体外后，其存活时间与肠道主要致病菌大致相似，在检验方法上，也以大肠菌群的检验计数简便易行。 因此，我国选用大肠菌群作为粪便污染指标菌是比较适宜的。,作为粪便污染的指标细菌还有：分叉杆菌(Bifidobacterium)、拟杆菌(Bacteroides)、乳酸菌、肠杆菌科中的梭状芽胞和底群链球菌等。 这些肠道内的其他细菌，虽与粪便有关，因为比不上大肠菌群所具备的指标特异性，所以目前还没有列入作为公认的粪便污染的指标细菌。,