贵州大学生物工艺学原理(无菌技术)

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1、生 物 工 艺 学,使用班级: 生物工程09级 教 师: 吴鑫颖 日 期: 2012年3月2012年7月 教 材：国家十一五规划教材生物工艺学（邱树毅主编）,目 录,第一章 绪论 第二章 工业微生物菌种选育、制备与保藏 第三章 工业培养基及其设计 第四章 生物工艺过程中的无菌技术 第五章 生物反应动力学 第六章 发酵过程原理 第七章 生物反应器及生物工艺过程的放大 第八章 生物反应过程参数检测与控制 第九章 生物产品分离及纯化技术 第十章 生物产品工艺学及应用,第四章 生物工艺过程中的无菌技术,4.1 生物反应过程中无菌的要求 4.2 工业常用无菌技术 4.2.1 干热灭菌 4.2.2 湿热灭

2、菌 4.2.3 射线灭菌 4.2.4 化学药剂灭菌 4.2.5 过滤除菌 4.3 培养基灭菌 4.3.1 湿热灭菌原理 4.3.2 分批灭菌 4.3.3 连续灭菌 4.4 空气除菌 4.4.1 空气除菌方法 4.4.2 空气除菌流程 4.5 设备及管道灭菌,灭菌指利用物理和化学的方法杀灭or除去物料及设备中的一切生命物质的过程。 消毒是指用物理和化学的方法杀死物料、设备、器具内外的病源微生物。 消毒不一定能达到灭菌的要求，而灭菌可达到消毒的目的。,4.1 生物反应过程中无菌的要求,通常工业上采取的主要措施是： (1)对培养基进行灭菌处理； (2)对好氧过程的空气进行灭菌处理； (3)对生物反应

3、器(发酵罐)及其连接管道进行灭菌处理； (4)菌种为无污染的纯粹种子； (5)使生物反应器处于正压环境； (6)对培养过程中补料进行灭菌处理等。,4.2.1 干热灭菌,4.2 工业常用无菌技术,4.2.2 湿热灭菌,4.2.3 射线灭菌,4.2.4 化学药剂灭菌,4.2.5 过滤除菌,干热灭菌时，微生物主要由于氧化，体内蛋白质变性和电解质浓缩引起中毒等作用而死亡。 (1)灼烧法。常用于实验室接种针、勺、试管或三角瓶口和棉塞的灭菌，也用于工业发酵罐接种时的火环保护。 (2)烘箱热空气法。将物品放入烘箱内，然后升温至150170，维持12小时。经过烘箱热空气可以达到彻底灭菌的目的。该法适用于玻璃、

4、陶瓷和金属物品的灭菌。其优点是灭菌后物品干燥，缺点是操作所需时间长，易损坏物品，对液体样品不适用。,4.2.1 干热灭菌,湿热灭菌：利用饱和蒸汽释放的热能使微生物细胞中的蛋白质、酶、核酸等分子内的化学健受到不可逆破坏而进行灭菌的方法。湿热蒸汽具有较高的穿透能力，温度每升高10 ，细胞死亡速率常熟增加810以上。 通常湿热灭菌条件为121，维持30min。 高压蒸汽灭菌是实验室、发酵工业生产中最常用的灭菌方法。一般培养基、玻璃器皿、无菌水、缓冲液、金属用具等都可以采用此法灭菌。,4.2.2 湿热灭菌,射线灭菌：利用紫外线、高能电磁波或放射性物质产生的高能粒子进行灭菌的方法，其中以紫外线（260n

5、m）最常用。其杀菌作用主要是因为导致DNA胸腺嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体和胞嘧啶水合物，抑制DNA正常复制。此外，空气在紫外线辐射下产生的臭氧有一定杀菌作用。,4.2.3 射线灭菌,某些化学试剂能与微生物发生反应而具有杀菌作用。常用的化学药剂有75%（v/v）酒精、甲醛、漂白粉(或次氯酸钠)、高锰酸钾、过氧乙酸、环氧乙烷、季铵盐等。化学药剂不能用于培养基的灭菌，一般应用于发酵工厂环境、器具等的消毒。,4.2.4 化学药剂灭菌,环氧乙烷灭菌柜,过滤除菌：利用过滤法阻留微生物以达到除菌的目的。此法仅适用于不耐高温、澄清的液体培养基组分和空气的过滤除菌。,4.2.5 过滤除菌,4.3.1 湿热灭菌原理

6、,4.3培养基灭菌,4.3.2 分批灭菌,4.3.3 连续灭菌,4.3.1.1 微生物热阻,热灭菌原理： 每种微生物都有一定的生长温度范围。当微生物处于超过生长温度的上限的环境时，微生物细胞中的蛋白质等大分子物质会发生不可逆变性，使微生物在很短的时间内死亡，加热灭菌就是根据微生物的这一特性进行的。一般微生物的营养细胞在60加热10min全部死亡；细菌芽孢能耐受较高的温度，在100需要数分钟甚至数小时才能被杀灭。某些嗜热菌的芽孢在120下需30min甚至更长时间才能杀灭。所以，一般衡量灭菌彻底与否，是以能否杀灭芽孢细菌为标准。,4.3.1 湿热灭菌原理,致死温度：杀死微生物的极限温度；或指在一定

7、时间内杀死微生物的最低温度。 致死时间：在致死温度下，杀死全部微生物所需要的最少时间。在致死温度以上，温度愈高，致死时间愈短。热阻：微生物对热的抵抗力，即指微生物在某一特定条件下(主要是温度)的致死时间。相对热阻：指某一条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间之比。,对数残留定律：在一定温度下，微生物受热致死遵循分子反应速率理论，微生物受热死亡的速率dN/dt在任何瞬间与残留的活菌数N成正比，其数学表达式为式中：N残留活菌数，个；t受热时间，min；k反应速率常数，比死亡速率常数，s-1。k也称灭菌速率常数；k是微生物耐热性的一种特征，随微生物的种类和灭菌温度不同而不同。 k越小，微

8、生物越耐热。dN/dt活菌数瞬时变化速率，即死亡速率。,4.3.1.2湿热灭菌的对数残留定律,若开始灭菌(t=0)时，培养基中活的微生物数为N0，将上式积分后可得到式中：N0开始灭菌时原有的活菌数，个；Nt经过t时间灭菌后的残留菌数，个。 亦可看出，如果要求完全彻底灭菌，即残留菌数Nt=0时，需要的灭菌时间为无穷大， 此式即无意义，事实上是不可能的。因此，工程上进行灭菌设计时，一般采用Nt=0.001，即在1000次灭菌中允许有一次染菌机会。,4.3.1.2湿热灭菌的对数残留定律,在实际过程中某些微生物受热死亡的速率是不符合对数残留规律的。将其N0/Nt对灭菌时间t在半对数坐标中标绘得到的残留

9、曲线不是直线。呈现这种热死亡非对数动力学行为的主要是一些微生物芽孢。有关这一类热死亡动力学的行为，以Prokop和Hunphey所提出的“菌体循序死亡模型”最有代表性，其假设耐热性微生物芽孢的死亡不是突然的，而是渐变的，即耐热性芽孢(R型)先转变为对热敏感的中间态芽孢(S型)，然后转变成死亡的芽孢(D型)，这一过程可用下式表示NR耐热性活芽孢数(R型)；NS敏感性活芽孢数(S型)；ND死亡的芽孢数(D型)；,4.3.1.3 湿热灭菌的非对数残留定律,根据对数残留定律，联立微分方程可得式中：Nt任一时刻具有活力的芽孢数，即Nt = NS + NR；N0初始的活芽孢数；kR耐热性芽孢的比死亡速率，

10、s-1；kS敏感性芽孢的比死亡速率，s-1。 在温度相同时，对数与非对数定律的灭菌时间t不同。,4.3.1.3 湿热灭菌的非对数残留定律,4.3.1.4 灭菌温度和时间的选择,微生物的受热死亡属于单分子反应，其灭菌速率常数k与温度之间的关系可用阿累尼乌斯方程表示：,式中：A阿累尼乌斯常数，s-1；R气体常数，8.314J/(molK)；T热力学温度，K；E微生物死亡活化能，J/mol 。 大部分培养基的破坏也可认为是一级分解反应，若其他条件不变，培养基成分分解速率常数和温度的关系也可用阿累尼乌斯方程表示。,当培养基受热温度从T1上升至T2时，微生物的比死亡速率常数k和培养基成分分解破坏的速率常

11、数k变化情况为 对微生物的死亡情况而言将上述两式相除并取对数后可得培养基成分的破坏，同样也可得两式相除得,4.3.1.4 灭菌温度和时间的选择,由于灭菌时杀死微生物的活化能大于培养基成分破坏的活化能E，因此随着温度的上升，微生物比死亡速率常数增加倍数要大于培养基成分破坏分解速率常数的增加倍数。也就是说，当灭菌温度升高时，微生物死亡速率大于培养基成分破坏的速率。根据这一理论，培养基灭菌一般选择高温快速灭菌法，则为达到相同的灭菌效果，提高灭菌温度可以明显缩短灭菌时间，并可减少培养基因受热时间长而遭到破坏的损失。,4.3.1.4 灭菌温度和时间的选择,4.3.1.4 灭菌温度和时间的选择,灭菌温度和

12、完全灭菌时间对维生素B1破坏量的比较,不同成分的培养基其含菌量是不同的。培养基中微生物数量越多，达到无菌要求所需的灭菌时间也越长。天然基质培养基，特别是营养丰富或变质的原料中含菌量远比化工原料的含菌量多，因此，灭菌时间要适当延长。含芽孢杆菌多的培养基，要适当提高灭菌温度并延长灭菌时间。,4.3.1.5 影响培养基灭菌的其他因素,培养基成分,培养基pH,培养基物理状态,泡沫,微生物数量,pH对微生物的耐热性影响很大，pH为6.08.0时微生物耐热能力最强，pH小于6.0时，H+易渗入微生物细胞内，改变细胞的生理反应促使其死亡。所以培养基pH愈低，灭菌所需时间愈短。,因为热的传导及对流作用使固体培

13、养基的灭菌时间要比液体培养基的灭菌时间长。 假如100时液体培养基的灭菌时间为1h，而固体培养基则需要23h才能达到同样的灭菌效果。,泡沫中的空气形成隔热层，使传热困难，对灭菌极为不利。需对易产生泡沫的培养基加入少量消泡剂后再进行灭菌。,高浓度有机物会在细胞的周围形成一层薄膜，从而影响热的传入，使灭菌温度高些。如培养基中的油脂、糖类及一定浓度的蛋白质会增加了微生物的耐热性。,4.3.2 分批灭菌,培养基的分批灭菌：就是将配制好的培养基放在发酵罐或生物反应器中，用直接蒸汽或间接蒸汽将培养基和所用设备加热到灭菌温度(一般121)，并在此温度维持一定时间，再冷却到发酵温度 ，此操作过程，也称为实罐灭

14、菌。分批灭菌过程包括升温、维持和冷却三个阶段 空消：是对发酵罐设备及其周边连接管道进行灭菌处理。 优点：培养基的分批灭菌不需要专门的灭菌设备，对蒸汽要求低，投资少，设备简单，灭菌效果可靠。 缺点：在灭菌过程中蒸汽消耗量大，造成锅炉负荷波动大。 应用：常用于中、小型发酵罐的培养基灭菌。,分批灭菌步骤：通常应先把发酵罐的分空气过滤器灭菌并用空气吹干。 开始灭菌时，放去夹套或蛇管中的冷水，开启排气管阀，通过空气管向罐内的培养基通过蒸汽进行加热。 当培养基温度升到75左右时，从取样管和放料管向罐内通入蒸汽，培养基温度达到120，罐压达1105Pa(表压)时，安装在发酵罐上封头的接种、补料、消泡剂、酸、

15、碱管道应排气，并调节好各进气和排气阀门，使罐压和温度保持在这一水平进行保温。 在保温阶段，凡进口在培养基液面下的各管道以及显示镜管都应通入蒸汽，在液面上的其余各管道则应排放蒸汽。 保温结束后，依次关闭各排气，进气阀门，待罐内压力低于空气压力后，向罐内通入无菌空气，在夹套或蛇管中通冷却水，使培养基温度降到所需温度。,培养基的连续灭菌：是将配好的培养基在向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热、保温和冷却的灭菌过程。,图4- 1 连续灭菌过程中温度变化,4.3.3 连续灭菌,优点：可采用高温短时灭菌，培养基受热时间短，营养成分损失少，有利于提高发酵率,发酵罐利用及产量；产品质量较易控制。蒸汽负荷均衡，

16、锅炉利用率高，操作方便。适宜采用自动控制。劳动强度低采用板式换热器时，可节约大量能量。但对培养基中含有较多的固体颗粒或泡沫时，采用分批灭菌较好。,连续灭菌的基本设备一般包括： 配料预热罐：将配好的料液预热到6070，以避免灭菌时由于料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声； 加热装置：主要作用是通过直接蒸汽或间接蒸汽使料液温度快速上升到灭菌温度，常有连消泵（塔）、蒸汽喷射加热器、薄板换热器等； 维持器：在灭菌温度下使料液维持一段时间，达到灭菌效果； 冷却器：从加热的料液要冷却降温至发酵温度，满足生产要求。生产上一般采用冷却水喷淋冷却、闪蒸罐（真空冷却器）、薄板换热器等。,4.3.3 连续灭菌,冷却器,常用连续灭菌工艺流程,4.3.3.1连消塔喷淋冷却流程 4.3.3.2喷射加热真空冷却流程4.3.3.3板式换热器灭菌流程,