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1、实验二十、食品中黄曲霉毒素B1的检测,标准依据: GB/T5009.22-2003食品中黄曲霉毒素B1的测定,一、实验目的与要求： 1、学习酶联免疫(ELISA)方法测定粮食及食品中黄曲霉毒素B1的实验原理，掌握实验的操作要点及测定方法 2、了解酶联免疫(ELISA)的工作原理，正确熟练使用酶标仪。二、实验原理： 本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，样品中的黄曲霉毒素B1经提取、脱脂、浓缩后与定量特异性抗体反应，多余的游离抗体则与酶标板内的包被抗原结合，加入酶标记物和底物后显色，与标准曲线比较测定含量。,三、仪器与试剂,（一）试剂盒组成 1、 AFB1抗原包被16孔6条形带框酶标板； 2、抗体
2、； 3、酶标二抗； 4、空白对照液； 5、底物（1mg4）； 6、底物液A； 7、底物液B； 8、终止液； 9、PBS一T洗液； 10、一次性手套。 （二）仪器 1、酶标仪； 2、离心机。,四、实验步骤,（一）样品中AFB1的提取 1 大米和小麦（脂肪含量3.0）： 样品粉碎后过20目筛，称取20.0g，加入250m1具塞锥形瓶中。准确加人60mL三氯甲烷，盖塞后滴水封严，150rpm振荡30min。静置后，用快速定性滤纸过滤于50mL烧杯中，立即取12mL滤液（相当4.0g样品）于75mL蒸发皿中。65水浴通风挥干。用2.0mL甲醇一PBS (20+80)分三次（0.8mL、0.7mL、0.
3、5mL）溶解并彻底冲洗蒸发皿中凝结物，移至小试管加盖振荡后静置待测。此液每毫升相当2.0g样品。,2. 玉米（脂肪含量3.05.0）： 样品粉碎后过20目筛，称取20.0g，加入250mL具塞锥形瓶中。准确加入50.0mL甲醇一水（80+20）溶液和15.0mL石油醚，盖塞后滴水封严，150rpm振荡30min。用快速定性滤纸过滤于125mL分液漏斗中,待分层后，放出下层甲醇水溶液于50mL烧杯内，从中取10.0mL （相当于4.0g样品）于75mL蒸发皿中,以下按上述“65水浴通风挥干”起，依法操作。 3花生（脂肪含量15.045.0）： 样品去壳去皮粉碎后称取20.0g，加入250mL具塞
4、三角瓶中，准确加人100.0mL甲醇水(55 45）溶液和30mL石油醚,盖塞后滴水封严，150rpm振荡30min，静置15min后用快速定性滤纸过滤于125mL分液漏斗中，待分层后，放出下层甲醇水溶液于100mL烧杯内，从中取20.0 mL（相当于4.0g样品）置于另一125mL分液漏斗中，加入20.0mL三氯甲烷，振摇2min，静置分层（如有乳化现象可滴加甲醇促使分层）放出三氯甲烷于75mL蒸发皿中，再加5.0mL三氯甲烷于分液漏斗中重复振摇提取后，放出三氯甲烷层一并于蒸发皿中，以下按上述“65水浴通风挥干”起，依法操作。,4植物油： 用小烧杯称取4.0g样品，用20.0mL石油醚，将样
5、品移于125mL分液漏斗中，用20.0mL 甲醇水(55 45）溶液分次洗烧杯，溶液一并移人分液漏斗中。（精炼油4.0g样为4.575mL，可直接用移液器加入分液漏斗再加溶剂后振摇）振摇2min，静置分层后，放出下层甲醇水溶液于750mL蒸发皿中。再用5.0mL甲醇水溶液重复振摇提取一次，提取液一并加入蒸发皿中，以下按自“65水浴通风挥干”起，依法操作。 5其它食品：可按照G8 5009有关章节提供的方法操作，最终提取物（相当于4.0g样 品）应收集于2.0m1甲醇一PBS(2080)中。,（二）样品测定,1、将下列试剂稀释后备用 PBS一T洗液：390mL蒸榴水稀释（1:40）； 底物液A:
6、 9mI蒸溜水稀释（1:9）； 抗体: 7.0mL洗液稀释（1:140）； 酶标二抗:10mL洗液稀释（1:200）； 阴性对照液:200l抗体十200l空白对照液在玻璃试管内混合振荡后静置。,2、抗体抗原反应 将抗体与等量样品提取液（溶液为甲醇一PBS）在玻璃试管内混合振荡后室温 静置15分钟。启封酶标板，用洗液23分钟洗板后在吸水纸上拍干，分别在适当孔位加入此抗体抗原反应液及空白对照液（3孔）和阴性对照液（3孔）,130l孔,37湿盒中孵育（或加盖以保持相对湿度），2小时后，倒掉反应液并拍干,用洗液33分钟洗板，拍干。 3、酶标记反应 加入酶标二抗，100l孔，37盒中孵育1小时后，用洗液
7、53分钟洗板，拍干。 4、显色反应 lmg底物十2.5m1底物液A 42l底物液B，待底物充分溶解后加入酶标板，100l孔，3715分钟后加终止液40l孔。 5、测定 酶标仪490nm测定各孔0.D值。,五、数据处理及计算结果,1、求出各孔的0.D校正值：0.D校正值O.D实测值一空白对照孔0.D值（均值）。 2、求出待测样的0.D值：0.DO.D校正值/阴性对照孔0.D校正值（均值） 100。 3、求出待测样AFB1含量（ngg）：在标准竞争抑制曲线上找到待测样0.D值（座标Y值）的对应点，该点座标X值的反对数（10x）即为样品中AFB1的含量（ngg）,六、使用进口试剂盒检测的主要实验步骤
8、,1、样品提取：取5.0g样品与锥形瓶中，加入70甲醇25ml，振摇3min，过滤于分液漏斗中，静置分层，放出下层的甲醇水提取液，即为样品提取液。（亦可根据样品中黄曲霉毒素含量进行适当稀释为待测样液） 2、免疫反应：红色微孔中加入蓝色试剂100l，分别加入标准品和样品各100l，三次混匀，移100l到白色抗体孔，摇匀，室温反应10min，弃去液体，用去离子水洗5次，用吸水纸扣干。 3、显色反应：加入绿色试剂100l，摇匀，室温反应10min，加入红色试剂100l，终止反应。 4、结果检测：在450nm处用酶标仪检测。,七、注意事项及说明,1、带手套操作。酶标板用后处理，不能重复使用。样品提取过
9、程中用过的玻璃仪器需要重复使用时，应作解毒处理后,再洗涤。 2、操作时应手持酶标板板框，避免液体等沾污板底部，以保持酶标洁度。 3、试剂盒如需分次使用，应在每次使用前根据用量稀释试剂，每次用多少稀释多少，剩下的酶标板和试剂，应及时封存，4保存备用。如需保存较长时间则应-20保存。 但反复冻融后，将导致抗体效价下降。 4、结果判定：根据参考资料三：现行国家食品（饲料）卫生标准中规定的AFB1允许量标准对检测样品AFB1污染程度进行判定。 5、具体分析还要根据试剂盒的具体要求。,八、思考题,1、简述ELISA方法定量检测黄曲霉毒素B1的原理？ 2、实验对样品进行前处理的作用？ 3、影响检测准确性主要有哪些因素？ 4、酶标仪操作过程要注意些什么？,
