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1、高效液相色谱法：特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。它在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实验技术建立的一种液相色谱分析法。高压：150-350*105 Pa高效：大于30000塔板/米高灵敏：10-9g （紫外检测）、10-11g （荧光检测）,第三章 高效液相色谱分析法 HPLC（High Pertormance Liquid Chromatography，）2-1 高效液相色谱法的特点,一、HPLC与GC差别,1分析对象的区别GC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品；但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品，尤其对
2、大多数生化样品不可检测 占有机物的20%HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质溶液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分子和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80%,2流动相差别的区别 GC：流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相有相互作用。 HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改变流动相极性和pH值也对分离起到调控作用，当选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相也可以增大分离选择性。 3操作条件差别 GC：加温操作 HP
3、LC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）,二、高效液相色谱仪流程图,三、HPLC的特点和实际应用,1、利用其高柱效（n=104片/米），有效分离极复杂 体系中的痕量组分。正相色谱分离有机溶剂中的物质反相色谱分离水溶液中的物质-生化物质。 2、用离子型固定相建立的离子交换色谱和离子对色谱法分析离子型体的含量。（蛋白质、氨基酸、常见阴阳离子等） 3、利用多孔凝胶固定相建立空间排阻色谱法可分离高分子化合物。 4、利用手性固定相可以拆分分离具有手性的化合物。,2-2 基本理论和条件选择,基础 理论,热力学理论：塔板理论平衡理论 动力学理论：速率理论Vander方程,一、塔板理论,1.,二、速率理论（与
4、GC对比）,2）涡流扩散项及其影响,2.,讨论：1）流动相流速对HPLC板高的影响（与GC对比）,3）传质阻抗项及其影响,1,三、 影响分离的因素,1. 固定相与装柱方法的选择：选粒径小的、分布均匀的球形固定相（dp10m）首选化学键合相，匀浆法装柱 2. 流动相及其流速的选择：选粘度小、低流速的流动相甲醇，约1ml/min 3. 柱温的选择：选室温250C左右,四、HPLC法中分离条件的选择,一、液固吸附色谱法（LSC） (liquid-solid adsorption chromatography) 二、液液分配色谱法（LLC）(liquid-liquid partition chroma
5、tography,chemical bonded phase chromatography 三、离子色谱法（IC）（ion-exchange chromatography and ion pair chromatography) 四、空间排阻色谱法（SEC）（ steric exclusion chromatography,2-3 各类高效液相色谱法简介,1分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性中心能力的差异,分离前提：K不等或k不等,一、液固吸附色谱法（LSC） 流动相为液体，固定相为固体吸附剂,2固定相：与LC比，固定相粒径不同（17% 分配色谱 硅胶失活载体吸附的水固定液,1分离机
6、制：利用组分在两相中溶解度的差异 2固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法）缺点：系统内部压力大，易流失，不实用固定液极性NLLC固定液非极性RLLC 3正相色谱固定液极性 流动相极性（NLLC）极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱适于分离极性组分反相色谱固定液极性 固定相极性底剂 + 有机调节剂（极性调节剂）例：水 + 甲醇，乙腈，THF,4流动相极性与k的关系：流动相极性，洗脱能力，k，组分tR 5出柱顺序：极性大的组分先出柱极性小的组分后出柱 6适用：非极性中等极性组分（HPLC80%问题）,（三）正相键合相色谱,1分离机制：溶质分子与固定相之间定向作用力、诱导力、或氢键作用力 2固定
7、相：极性大的氰基或氨基键合相 3流动相：极性小（同LSC）底剂 + 有机极性调节剂 例：正己烷 + 氯仿-甲醇，氯仿-乙醇,4流动相极性与k的关系：流动相极性，洗脱能力，组分tR，k 5出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先出柱极性大的组分后出柱 6适用：氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小） 分离物质也相似氨基键合相与硅胶性质差别大，碱性分析极性大物质、糖类等,1反相离子对色谱法（IPC或PIC）,反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分 与其中的反离子形成中性离子对，增加k和tR，以改善分离,1）离子对试剂：烷基磺酸钠分析碱四丁基季胺盐分析酸 2）影响k的因素 a与m的极性
8、有关（同反相色谱） b与R的链长有关：R长，极性小，tR，k 3）适用：较强的有机酸、碱,三、离子色谱法（IC）,2反相离子抑制色谱,在反相色谱中，通过加入缓冲溶液调节流动相pH值，抑制 组分解离，增加其k和tR，以达到改善分离的目的,1）离子抑制剂：弱酸、弱碱性物质pH一定的缓冲溶液 2）k的影响因素：与流动相极性有关，还与pH值有关 选择流动相：应同时考虑极性及pH值 酸性物质加入酸HAc tR，k 碱性物质加入碱NH3H2O tR，k 调节pH范围：3.08.0pH8.0 破坏键合相与载体的结合pH3.0 腐蚀柱子 3）适用：极弱酸碱物质pH=37弱酸；pH=78弱碱；两性化合物,2对流
9、动相的要求：,1）与固定液不反应 2）对样品有良好溶解度k=110k=25 最理想的 3）与检测器匹配：UV（常用，测定波长应大于溶剂的截止波长）荧光，电化学 4）使用粘度小、纯度高的流动相（甲醇，乙腈）使用前过滤、脱气,3洗脱方式,1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵） 类似GC的等温度洗脱 2）梯度洗脱：在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例即不断改变其极性（两个泵） 适于分析极性差别较大的复杂组分类似GC的程序升温（沸程较长样品）,2-4 高效液相色谱仪,1泵：恒压泵：流量精度不稳恒流泵：常用 2进样装置1）隔膜进样（高分子有机硅胶垫进样室） GC系统压
10、力较小，可以HPLC系统压力太大，必须停泵进样（早期）2）阀进样：不必停泵，六通阀,液相色谱,3色谱柱：直径46mm,柱长1030cm柱效评价：色谱系统适应性试验R，n，fs（拖尾因子）柱再生：维护、保养、柱子的冲洗 4检测器1）紫外检测器：适于吸收紫外光的物质2）荧光检测器：只能分析自身发光的物质灵敏度高3）示差折光检测器：利用折光率的差别灵敏度低，温度要求严格4）电化学检测器5）化学发光,第四章 电位分析法(Potentiometry) 4-1 电化学分析法概述一、电化学分析( electrochemical analysis )根据物质在溶液中的电化学性质及其变化来进行分析的方法称电化学
11、分析。它是以溶液电导、电位、电流和电量等电化学参数与被测物质含量之间的关系作为计量基础。电化学分析方法主要有下面几类：1.电导分析法： 测定电阻参量2.电位分析法： 测定电压参量3.电解分析法： 测定电量参量4.库仑分析法： 测定电流-时间参量5.极谱法和伏安： 测定电压-电流参量,二、电化学电池( electrochemical cell )它是由一对电极、电解质和外电路三部分组成，它常分为原电池和电解池两类。原电池（primary cell）：自发的将电池内部进行的化学反应所产生的能量转化成电能的化学电池。电解池（electrolytic cell）：实现电化学反应的能量由外电源供给的化学
12、电池，它是将电能转变为化学能。,三、电池的电动势( E电池 )电池的电动势：是指当流过电池的电流为零或接近于零时两极间的电位差。其中E 0代表氧化或还原半反应的电极电位、E相间电位 代表电池中的液接电位（来源于浓度差或盐桥）和膜电位。,四、电极上半反应的电极电位（E )电池中发生的反应是氧化还原反应，根据物理化学知识可知总反应常用氧化半反应和还原半反应来表示。电极上每个半反应的还原电极电位（E )与反应型体活度的关系由能斯特方程（Nernst equation ）表示：,若某一电极上半反应的方程式为：Ox + ne Red,则其电极电位为,五、电极的类型 1、基于电子交换反应的电极(1) 第一
13、类电极： M n+/M(2) 第二类电极： M/MX（固体）(3) 第三类电极： M/MX (s)，NX (s)， N n+， (4) 第零类电极： 惰性金属 2、选择性电极（1）离子选择性电极(ion selective electrode, ISE)包括常见的各种膜电极。（2）生物活性物选择性电极。包括组织电极和酶电极。（3）场效应微电子传感器（集成电极）,4-2 电位分析法原理电位分析法(potentiometry)：是基于测量浸入被测液中两电极间的电动势或电动势变化来进行定量分析的一种电化学分析方法，称为电位分析法。根据分析应用的方式又可分为直接电位法和电位滴定法。 直接电位法(dir
14、ect potentiometry) ：是将电极插入被测液中构成原电池，根据原电池的电动势与被测离子活度间的函数关系直接测定离子活度的方法。 电位滴定法 (potentiometric titration): 是借助测量滴定过程中电池电动势的突变来确定滴定终点，再根据反应计量关系进行定量的方法。,电位分析法的实质是通过在零电流条件下测定两电极间的电位差(即所构成原电他的电动势) 进行分析测定。由于电位法测定的是一个原电池的平衡电动势值，而电池的电动势与组成电池的两个电极的电极电位密切相关，所以我们一般将电极电位与被测离子活度变化相关的电极称指示电极或工作电极，而将在测定过程中其电极电位保持恒定不变的另一支电极叫参比电极。若参比电极的电极电位能保持不变，则测得电池的电动势就仅与指示电极有关，进而也就与被测离子活度有关。,
