实验动物胚胎工程技术

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1、第十二章 实验动物胚胎工程技术,2018/9/17,2,第一节 概述,工程:通过构想、设计，按照人们的意愿制作、改造某一事物，以达到预想的目的。 生物工程：按照工程学原理，对生物体或生物大分子进行改造或利用，用于生产、研究、检定和创造新物种的综合性科学技术。 遗传（基因）工程蛋白质工程酶工程细胞工程微生物工程胚胎工程组织工程,分子水平,细胞水平,组织水平,2018/9/17,3,胚胎工程（Embryonic engineering）又称胚胎技术,是指用工程学的原理对动物的胚胎进行某种技术操作或改造，使之获得人们所需要动物的一系列生物技术的总称。 一、胚胎操作基本技术1.超数排卵和卵母细胞、精子

2、、受精卵的采集2.体外受精3.胚胎性别控制4.胚胎分割5.胚胎培养6.胚胎移植7.胚胎冷冻保存 二、体细胞克隆技术 三、干细胞技术 四、外源基因导入技术,2018/9/17,4,胚胎工程的应用,1.畜牧业：通过建立超数排卵、受精卵/卵母细胞的采集、体外受精、胚胎切割、胚胎性别控制、体细胞克隆以及胚胎移植技术，加快良种家畜的繁殖和家畜品种的改良。,2018/9/17,5,2.生物制药：通过转基因技术将具有药用价值的生物活性蛋白的基因整合到宿主的染色体上，使其在乳汁、血液、尿液等体液中表达。通过收集、纯化这些体液中的生物活性蛋白，用于预防和治疗某些人类的疾病。,已在乳腺表达的生物活性蛋白并进入临床

3、2期或3期试验： 抗凝血酶一 抗胰蛋白酶 蛋白C 乳铁蛋白 乳糖酶,2018/9/17,6,3.医学：通过建立卵母细胞的采集、体外受精、显微受精以及胚胎移植技术，用于不孕症的治疗；通过对胚胎培养和检测，剔除具有遗传性疾病的胚胎，达到优生优育的目的。 4.生命科学研究：阐明哺乳动物早期胚胎发生、发育机制等基础理论。 5.拯救濒危野生动物：通过野生动物生殖细胞和组织的冷冻保存、体细胞克隆和胚胎移植技术，扩大野生动物的种群。,2018/9/17,7,第二节 胚胎操作基本技术,2018/9/17,8,胚胎操作的整个过程局限在胚胎的早期发育,2018/9/17,9,一、精子、卵母细胞、受精卵的采集和超数

4、排卵,1.精子的采集 啮齿类小动物精子的采集大都从体成熟雄性动物的附睾获取。将动物处死后，分离附睾尾部，用眼科剪子在顶端剪一小口，用手指轻柔挤出浓稠的液滴，置培养液中培养。 大动物的精子采集可采用假阴道或电刺激法促进雄性射精，收集精液。,2018/9/17,10,2.卵母细胞和受精卵的采集 从体内成熟并排到输卵管中去，需通过处死动物或外科手术获取卵母细胞；如果在交配后，则可获取受精卵或早期胚胎。 取自屠宰淘汰的或刚死亡的雌性动物的卵巢，从卵巢中分离卵母细胞经培养而得。,2018/9/17,11,3.超数排卵（Superovolation）技术： 通过注射激素刺激卵巢大量排卵。经超数排卵处理，动

5、物卵巢大量的卵泡同时成熟并排出，排卵数可增加几倍至十几倍，一次可获得大量的卵细胞、受精卵或早期胚胎。 所用激素有促卵泡激素（FSH）、人绒毛膜促性腺激素(HCG)和孕马血清促性腺激素（PMSG）、孕酮和前列腺素（PG）等，以前三种常用。,2018/9/17,12,2018/9/17,13,二、体外受精,体外受精（In vitro fertilization）是指成熟精子与卵母细胞在体外环境下完成受精的过程。这一过程包括卵母细胞的收集或未成熟卵母细胞的培养成熟、精子的获取、获能处理、受精及受精后胚胎培养等。体外受精（IVF）联合胚胎移植技术又称试管婴儿技术。,2018/9/17,14,三、胚胎性

6、别控制,性别控制的研究，是畜牧业生物技术中一项重要的高新技术。这项技术的应用，可以使畜牧上大动物的繁殖按照人们的意愿只生产同一性别动物。 在医学上，性别控制的研究也具有积极的意义。有的遗传性疾病属于性连锁遗传，例如进行性肌营养不良，为X连锁隐性遗传，男性发病，女性携带异常基因但不发病。携带此致病基因的女性怀孕后如做胚胎性别鉴定，则可避免男性患儿的出生。,2018/9/17,15,性别控制技术 通过对X精子与Y精子分离以控制性别。 在胚胎移植前对胚胎的性别进行鉴定以控制性别。 通过控制饲料特性、受精环境如改变精液或阴道的PH值等来控制性别。,2018/9/17,16,（一）分离X精子与Y精子以控

7、制性别分离X精子与Y精子的依据：X、Y精子在体积、密度、电荷、运动性和DNA含量、表面抗原等方面存在差异。将X和Y精子分离再通过人工授精可以有效地达到性别控制的目的。目前将X和Y精子分离的方法有沉降法、电泳法、免疫法和流式细胞仪法等。流式细胞仪法是当前分离X、Y精子较准确的方法，具有重复性、科学性和有效性的特点。,2018/9/17,17,应用流式细胞仪分离X和Y精子的原理： X精子的DNA含量比Y精子的高。对于奶牛，X精子比Y精子DNA含量高3.8，由于染料着色量与精子DNA含量成正比，因此X精子吸收的染料多，发出的荧光就比Y精子强。,2018/9/17,18,具体的做法： 先用DNA特异性

8、染料对精子进行活体染色，然后精子连同少量稀释液逐个通过激光束。探测器根据精子的发光强度把电信号传递给计算机，计算机指令液滴充电使发光强度高的液滴带正电，弱的带负电。即X精子带上正电荷，Y精子带上负电荷。当经过高压电场时会向不同方向偏转，达到分离的目的。,2018/9/17,19,（二）对胚胎进行鉴定以控制性别在胚胎移植前对胚胎的部分组织用染色体检查、间接免疫荧光法和PCR法进行性别鉴定。其中PCR法因有可靠的操作程序，具有高效、快速的特点，近年来得到迅速的发展。Y染色体短臂上有决定雄性的DNA片段-SRY基因(sex-determining region of Y-chromosome,全称:

9、Y染色体性别决定区)，为胚胎性别鉴定提供了可靠的途径。,2018/9/17,20,2018/9/17,21,四、胚胎培养,胚胎培养是指将获得的早期胚胎在体外人工环境中进行培养，以观察其发育或人工干预某一发育过程的可能性。,2018/9/17,22,胚胎培养一般应用于以下几个方面： 1.未成熟卵母细胞通过体外培养，成熟后进行体外受精。 2.受精卵通过体外培养发育成各阶段的早期胚胎，用于胚胎移植或胚胎冷冻保存。 3.冷冻保存胚胎解冻后，通过体外培养，筛选成活胚胎用于胚胎移植。 4.通过研究胚胎发育的环境和条件，不断完善胚胎培养条件，揭示胚胎细胞的生长发育和分化的奥秘。目前胚胎培养技术已经可以将未成

10、熟卵在体外成熟，并通过体外受精发育成各阶段的早期胚胎。即使如此，在体外胚胎培养也只能发育到囊胚期，需要在囊胚期前移植到动物的子宫内。,2018/9/17,23,五、胚胎移植,-胚胎工程的最后一道工序将受精卵或发育到一定时期的早期胚胎,移植到受体动物生殖管道的一定部位,能在子宫内着床、生长、发育、分娩、出生仔代动物的技术称为胚胎移植。 几乎所有的胚胎工程技术在体外完成对胚胎的操作后，都需经过胚胎移植这一步骤，得到我们所要的动物。,2018/9/17,24,体外培养的胚胎必须移植到同步发情的雌性动物生殖管道内。 1.利用自然同期发情的母畜，此法在实践上较难办到。 2.通过注射某些激素(如孕激素、雌

11、激素等)诱发同期发情。不同发育阶段的胚胎移植的部位不同。受精卵和2细胞胚胎应移植到输卵管内，而桑椹胚和囊胚期胚胎应移植到子宫内，以跟正常妊娠生殖生理变化同步。,2018/9/17,25,同一种属内的不同品种品系可互相进行胚胎移植。如近交系C57BL/6J小鼠的胚胎可移植到雌性封闭群ICR的生殖管道内；日本大耳白兔的胚胎可移植到雌性新西兰兔的生殖管道内。这一特点在畜牧业特别有用，如为了加快良种奶牛的繁殖，可将良种奶牛的胚胎移植到普通黄牛的生殖管道内，借腹怀胎。,2018/9/17,26,六、胚胎冷冻保存,胚胎冷冻保存（embryo cryopreservation）技术是指在低温（-196液氮内

12、）条件下利用低温保护剂保存生殖细胞及胚胎的一门技术。,2018/9/17,27,（一）胚胎冷冻保存的机制低温降低了胚胎内的生化反应速度。并且温度越低，保存时间就越长。低温损伤：如果冷却速度过慢，胞外溶液中水分大量结冰，溶液浓度提高，胞内水分大量渗出，导致细胞的强烈收缩和细胞处于高浓度的溶液中时间过长，从而造成化学损伤；如果冷却速度过快，胞内水分来不及通过细胞膜向外渗出，胞内溶液过冷而结冰，从而造成物理损伤。 在复温（解冻）过程中，如果复温速率不当也可能引起细胞内结冰（重结冰）而损伤。,2018/9/17,28,采用低温保护剂防止低温损伤：二甲基亚砜（DMSO）、聚乙烯砒咯烷酮(pvp)、甲醇、

13、乙二醇、羟甲基淀粉（HES）等可以避免或减少结冰的程度与速度，降低细胞周围未冻结溶液中的电解质浓度，从而避免或减少胚胎冷冻过程中所发生的物理和化学损伤。,2018/9/17,29,（二）胚胎冷冻保存技术的应用 1. 应用于实验动物的育种和保种。 应用于实验动物胚胎的长途运输。 应用于实验动物的生物净化。 应用于珍稀或濒危动物种质保存。,2018/9/17,30,第三节 动物体细胞克隆技术,2018/9/17,31,克隆（clone）的概念克隆是指无性繁殖或拷贝。无性生殖在植物中很常见，在动物中过去认为是不可能的。动物克隆是指动物通过体细胞核移植后生产出基因型几乎与供体完全相同的后代。,2018

14、/9/17,32,核移植（Nuclear transfer）是指将动物细胞的细胞核移植到另一个体的去核卵母细胞胞质中，通过电激活，使供体核重编程序，形成的重构卵在体外培养成胚胎，最后通过胚胎移植，使之发育成个体。如果受体去核卵和供体移入的核来自同种动物，则称种内核移植，来自不同的种则称为种间核移植。 核移植由于没有经过精子和卵子的受精过程，核移植动物的全部遗传信息来自供体核细胞，等于是复制了提供细胞核的动物，因而把它俗称为“克隆”。,2018/9/17,33,根据供体核的来源不同，核移植包括以下几种： 胚胎细胞核移植：未着床前的囊胚（未分化） 胚胎干细胞核移植（未分化） 胎儿成纤维细胞：出生前

15、的胎儿（未分化或低分化） 成年体细胞（已分化）,2018/9/17,34,动物克隆的实验过程,2018/9/17,35,动物克隆技术的意义与应用,加快良种家畜的繁殖速度 与体细胞转基因技术结合，能制备大家畜转基因动物 拯救濒危野生动物 治疗性克隆，用于再生医学,2018/9/17,36,再生医学技术路线简介,2018/9/17,37,第四节 干细胞技术,2018/9/17,38,一、概述 干细胞是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞。根据发育阶段，可将干细胞分为胚胎干细胞(embryonic stem cells，ES细胞)和成体干细胞(adult stem cells，AS细胞)。

16、 ES细胞存在于囊胚期胚胎的内细胞团中，是全能性、无限增殖的干细胞，在胚胎的生长发育过程中具有分化形成胎儿所有类型细胞、组织和器官的潜能。 AS细胞是ES细胞定植于胎儿和成人的各种组织和器官中的“种子”，具有自我更新和分化为组织特异细胞的能力，即分化为相应组织和器官中细胞的“专能”细胞，包括神经干细胞、脂肪干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、精原干细胞、皮肤干细胞和肝脏干细胞等。,2018/9/17,39,2018/9/17,40,诱导性多潜能干细胞(Induced pluripotent stem cells,iPS 细胞)2006年,Takahashi等首次发现导入特定的转录因子基因能够使已分化的细胞重编程回归到胚胎细胞状态。他们通过慢病毒载体介导将Oct4、Sox2、c-Myc 和Klf4 4 种转录因子基因导入小鼠皮肤成纤维细胞, 获得了具有强大的自我更新能力和分化潜能的多能性干细胞, 命名为iPS 细胞。这一研究克服了ES细胞和AS细胞应用存在的诸多问题，展现了广阔的应用前景，受到了整个生命科学领域的广泛关注。目前研究中较为理想的供体细胞主要有淋巴细胞(如T细胞和B细胞等)、脂肪细胞和皮肤成纤维细胞。,