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1、基因工程的基本操作程序,专题基因工程,基因工程的基本操作程序,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,1.基因工程的操作步骤正确的操作顺序是 使目的基因与运载体相结合将目的基因导入受体细胞 检测目的基因的表达是否符合特定性状要求 提取目的基因 A B C D,步骤一:目的基因的获取,目的基因是人们所需要转移或改造的基因, 获取目的基因是实施基因工程的第一步 。,如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因,还有植物的抗病(抗病毒、抗细菌)基因、种子贮藏蛋白的基因,以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。,目的基因的提取方法,人工合成基因,反转录法 根据已知的氨
2、基酸序列合成DNA,:鸟枪法,直接分离基因,从基因文库中获取,基因组文库,cDNA文库,1 . 鸟枪法(散弹射击法)用限制酶将供体细胞中的DNA切成许多片段,从中找出含有目的基因.,1)反转录法:以目的基因转录成的信使RNA为模板,反转录成互补的单链DNA,然后在酶的作用下合成双链DNA,从而获得所需的基因。,目的基因的mRNA,单链DNA(cDNA),双链DNA (即目的基因),反转录,合成,2.人工合成基因法,2)根据已知的氨基酸序列合成DNA法 :,根据已知蛋白质的氨基酸序列,推测出相应的信使RNA序列,然后按照碱基互补配对原则,推测出它的结构基因的核苷酸序列,再通过化学方法,以单核苷酸
3、为原料合成目的基因。,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,上述三种目的基因提取的方法有何优缺点?,操作简便广泛使用,工作量大,盲目,分离出来的有时并非一个基因,专一性强,操作过程麻烦,mRNA很不稳定,要求的技术条件较高,专一性最强,仅限于合成核苷酸对较少的简单基因,哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术?,1)DNA序列自动测序仪:2)PCR技术:,对提取出来的基因进行核苷酸序列分析。,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增。,3从基因文库中获取目的基因:,基因文库:将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,
4、各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库(gene library) 基因组文库:基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库. 部分基因文库:基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库.,用DNA重组技术将某种生物的总DNA用特定的限制性内切酶切割成一个个片段,然后将这些片段随机地连接在某些质粒或其他载体上,再将它们转移到适当的宿主细胞中,通过细胞的增殖而构成各个片段的无性繁殖系(克隆),当这些克隆多到可以包括某种生物的全部基因时,这一批克隆的总体就称为该种生物的基因文库。这一定义也适用于线粒体DNA和叶绿体DNA,分别称为某种生物的线粒
5、体基因文库或叶绿体基因文库。为了有效地保存基因文库,可通过细菌在固体培养基上繁殖而使包含各个特定DNA片段的细菌增多。通过分子杂交的方法,可以筛选出包含有所需基因的DNA片段的细菌(或噬菌体)。经过扩增得到大量这样的细菌(或噬菌体),从中便可分离出所需基因的DNA片段。建立和使用基因文库是分离高等真核生物基因的有效手段,对于基因定位和基因工程的研究都很有用。,步骤二:基因表达载体的构建,1)用一定的限制酶切割质粒,使其出现一个切口,露出黏性末端。2)用同一种限制酶切断目的基因,使其产生相同的黏性末端。3)将切下的目的基因片段插入质粒的切口处,再加入适量DNA连接酶,形成了一个重组DNA分子(重
6、组质粒),目的基因与运载体的结合过程,实际上是不同来源的基因重组的过程。,常用的受体细胞:,有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,将目的基因导入受体细胞的原理,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,步骤三:目的基因导入受体细胞,直接导入法有电击、显微注射、直接吸收、基因枪等方法。 (1)电击法:借助电击仪高压脉冲把目的基因打入宿主细胞。 (2)显微注射法:利用微量注射器在显微镜下直接把目的基因注入宿主细胞。 (3)直接吸收法:把目的基因和宿主细胞混在一起,让其吸收。 (4)基因枪法:在金属微粒上涂一层目的基因,然后发射到宿主细胞中。 间接导入法常用的载体是质粒、噬菌体、科斯质粒。
7、 (1)质粒是细菌染色体DNA以外的环状双链DNA分子,它能自我复制,也可整合到细胞染色体DNA中与其一起表达。质粒通常还含有标记基因,这可以从细胞的表型特征来识别。 (2)噬菌体是一种细菌病毒,其环状双链DNA可以作为目的基因的载体。 (3)科斯质粒是一种杂种质粒,含有质粒和噬菌体的部分顺序,很适合用作真核生物基因的载体。,1.将目的基因导入植物细胞,2.将目的基因导入动物细胞,3.将目的基因导入微生物细胞,大肠杆菌细胞最常用的转化方法是:首先用Ca2+ 处理细胞,以增大细菌细胞壁的通透性,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,这种细胞称为感受态细胞.第二步是将重组表达载体DN
8、A分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子,完成转化过程.第二步目的基因在受体细胞内,随其繁殖而复制,由于细菌繁殖的速度非常快,在很短的时间内就能获得大量的目的基因。,1)将细菌用CaCl2处理,以增大细菌细胞壁的通透性。2)使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。3)目的基因在受体细胞内,随其繁殖而复制,由于细菌繁殖的速度非常快,在很短的时间内就能获得大量的目的基因。,步骤四:目的基因的检测与鉴定,不能,受体细胞必须表现出特定的性状,才能说明目的基因完成了表达。,受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗?,若不能表达,要对抗虫基因再进行修饰。,前三
9、步的处理十分繁锁,为保证目的基因得到有效利用,通常用大量的受体细胞来接受不多的目的基因。这样,处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少,必须将它从中检测出来。,细菌的检测,将每个受体细胞单独培养形成菌落,检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落,保留有表达产物的进一步培养、研究。,多细胞生物的检测,将每个受体细胞单独培养并诱导发育成完整个体,检测这些个体是否摄入目的基因,摄入的基因是否表达(是否表现出相应的性状)。淘汰无变化的个体,保留有相应变化的个体进一步培养、研究。,例:用棉铃饲喂棉铃虫,如虫吃后不出现中毒症状,说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡,则说
10、明摄入了抗虫基因并得到表达。,1)以下说法正确的是 ( )A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列B、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运载体必须具备的条件之一是:具有多个限制酶切点,以便与外源基因连接D、基因控制的性状都能在后代表现出来,C,练习,2)不属于质粒被选为基因运载体的理由是A、能复制 ( )B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因D、它是环状DNA,D,练习,3)有关基因工程的叙述中,错误的是( )A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、 限制性内切酶用于目的基因的获得C、目的基因须由运载体导入受体细胞D、 人工合成目的基因不用限制性内切酶,A,练习,4)有关基因工程的叙述正确的是 ( )A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成C、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料,D,练习,5)基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中,不进行碱基互补配对的步骤是 ( )A、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合C、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达,C,练习,