《感染慢病毒HSV1-sr39tk的肾癌细胞GRC-1的建立》由会员分享，可在线阅读，更多相关《感染慢病毒HSV1-sr39tk的肾癌细胞GRC-1的建立（6页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、KKME-专业医学搜索引擎 http:/ HSV1-sr39tk 的肾癌细胞 GRC-1 的建立作者：张成静，陈仁富，温儒民，王军起，陈家存，郑骏年，孙晓青 作者单位：徐州医学院附属医院泌尿外科,江苏徐州【摘要】 目的 建立携带增强的突变型单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV1-sr39tk)基因的慢病毒感染的肾癌细胞株 GRC-1。方法 采用改良的磷酸钙沉淀法将包装质粒、包膜蛋白质粒和含目的基因的转移质粒共转染 293T 包装细胞，收集的病毒上清感染 GRC-1 细胞。结果 三质粒系统共转染 293T 细胞后获得较高滴度的慢病毒(2109 U/L)。经 RT-PCR 检测证实 HSV1-sr39tk
2、 基因已导入 GRC-1 细胞。结论 慢病毒载体可高效、稳定地感染 GRC-1 细胞，成功建立感染慢病毒 HSV1-sr39tk 的肾癌细胞株 GRC-1。【关键词】 突变型单纯疱疹病毒胸苷激酶;肾癌细胞; 慢病毒载体Establishment of human renal cancer cell line GRC-1transfected with lentiviral HSV1-sr39tkZHANG Chengjing, CHEN Renfu, WEN Rumin, WANG Junqi, CHEN Jiacun, ZHENG Junnian, SUN Xiaoqing(Departme
3、nt of Urology, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002, China)Abstract: Objective To establish the human renal cancer cell line GRC-1 transfected with lentiviral vector carrying the enhanced KKME-专业医学搜索引擎 http:/ herpes simplex virus thymidine kinase (HSV1-sr39tk). Metho
4、ds Lentivirus was generated by three-plasmid transfection, i.e., the VSV-G envelope expression cassette, the NRF packaging plasmid and the transfer plasmid containing target genes were co-transfected into 293T packaging cells by the enhanced calcium phosphate precipitation, and the collected lentivi
5、rus supernatant was applied to infect GRC-1cells. Results The three plasmids were co-transfected into 293T packaging cells and a high titer of lentivirus could be obtained (2109 U/L). Transduction of HSV1-sr39tk gene into GRC-1 cells (GRC-1/39tk cells) was validated by RT-PCR detection. Conclusion L
6、entivirus carrier can infect GRC-1 cells efficiently and steadily, and thus human renal cancer cell line GRC-1 infected with lentivirus HSV1-sr39tk were successfully established.Key words: HSV1-sr39tk gene; renal carcinoma cell; lentiviral vector自杀基因疗法已经广泛应用于各种肿瘤的基础研究和临床实验性研究中。HSV1-tk/GCV 系统是肿瘤自杀基因治
7、疗中研究最为广泛且疗效得到肯定的前体药物系统。将该系统导入肿瘤细胞，从而诱导肿瘤细胞凋亡，可用于肿瘤治疗的研究。本研究建立携带增强的突变型单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV1-sr39tk) 基因的慢病毒感染的肾癌细胞株 GRC-1 的方法。1 材料和方法1.1 主要材料 HSV1-sr39tk 由美国加利福尼亚大学 Sanjiv KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 教授惠赠。含 HSV1-sr39tk 的慢病毒载体转移质粒pTK151/39tk 由本室构建。人胚肾 293T 细胞、 GRC-1 细胞由本室保存。限制性内切酶、T4DNA 连接酶、总 RNA 抽提试剂盒及 RT-PCR 一步法试
8、剂盒均购自 Promega 公司。PCR 引物由 Invitrogen 公司合成。1.2 方法1.2.1 慢病毒颗粒的包装 采用改良的磷酸钙沉淀法进行转染。将转移质粒(pTK151/39tk 为实验组，pTK153 为对照组;实验组含 HSV1-sr39tk，对照组含绿色荧光蛋白)15 g、包装质粒 NRF 10 g、包膜蛋白质粒 VSV-G 5 g 共转染 293T 包装细胞，转染12 h 后，每日在荧光显微镜下观察对照组荧光表达情况，72 h 后收集上清，0.45 m 滤器过滤后分装贮存于-80备用。1.2.2 慢病毒感染 GRC-1 细胞及其鉴定 复苏的 GRC-1 细胞系于 37、体积
9、分数为 5%CO2 培养箱中传代培养,培养液为含青霉素 1105 U/L、链霉素 100 mg/L 及体积分数为 15%的小牛血清的RPMI 1640。达到实验所需细胞数量后将细胞稀释成 0.5108 个/ L,分转 24 孔培养板培养 24 h 后备转染。分 2 组(实验组和对照组) 按6109/L 将 GRC-1 细胞接种至 50 ml 培养瓶中。将上述包装好的病毒以感染复数(MOI)31 比例感染 GRC-1 细胞，培养 3 h 后加入 2 ml RPMI 1640 完全培养液继续培养，24 h 重复感染，48 h 后在荧光显微镜下观察对照组荧光表达情况。提取感染后的 GRC-1 细胞的
10、总RNA 行 RT-PCR。所用 PCR 引物序列如下：上游引物 P1 为 5-KKME-专业医学搜索引擎 http:/ GCT TCG TAC CCC GGC CAT-3，下游引物 P2 为 5-TCA GTT AGC CTC CCC CAT CT-3。按 RT-PCR 一步法试剂盒方法建立如下反应体系：AMVI Tfi 5反应缓冲液 10 l，dNTPs (每dNTP 10 mmol/L)1 l，上游引物 3 l，下游引物 3 l，25 mmol/L MgSO4 2 l，AMV 反转录酶(5 U/l)1 l，TfiDNA 聚合酶(5 U/l)1 l，RNA 样品 5 l，无核酶水 24 l
11、 ，终体积 50 l。反应条件：48反转录 45 min，94 AMV 酶灭活及RNA/cDNA/引物变性 2 min，94变性 30 s，60退火 1 min，68延伸 2 min，共 35 个循环，最后 68延伸 7 min。扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。2 结 果2.1 慢病毒的包装 三质粒系统共转染 293T 包装细胞后 12 h 即可在倒置荧光显微镜下观察到绿色荧光表达，2436 h 荧光表达亮度最强。24 h 后镜下见(70.04.2)% 的对照组细胞表达绿色荧光(图 1)。将慢病毒上清再感染 293T 细胞，测病毒滴度达 2109 U/L。图 1 对照组 293T 细胞转染
12、结果(1040)2.2 慢病毒感染 GRC-1 细胞及 HSV1-sr39tk 基因在 GRC-1细胞中的整合与鉴定 病毒感染 GRC-1 细胞后 24 h，在倒置荧光显微镜下约(60.14.7)% 的对照组细胞表达绿色荧光( 图 2)。提取 GRC-1/39tk 细胞总 RNA 后行 RT-PCR，扩增产物进行 1%琼脂糖凝胶电泳，见 1.16 kb 处有一条阳性条带, 与 PCR 扩增产物的期望值吻合KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 3),证实慢病毒成功感染 GRC-1 细胞且 HSV1-sr39tk 基因整合于GRC-1 细胞基因组中。3 讨 论单纯疱疹病毒 1 型胸苷激酶(HS
13、V1-tk)由 Moolten 等于 1986年首先报道，它是一种多功能酶，能广泛磷酸化嘌呤和嘧啶核苷类似物包括丙氧鸟苷(GCV)和无环鸟苷(ACV)等。表达 HSV1-tk 的肿瘤细胞能特异磷酸化 GCV 成单磷酸衍生物 (GCV-MP)，并进一步被细胞内酶代谢为三磷酸衍生物(GCV-TP)，GCV-TP 可掺入初生的DNA 导致染色体断裂和姐妹染色体交换1，使细胞分裂停滞在S/G2 期，主要通过凋亡机制致细胞死亡。本实验采用的是通过半随机序列诱变产生的 HSV1-tk 的突变型 HSV1-sr39tk，对 GCV/ACV具有更高敏感性2，其原因在于 HSV1-tk 酶活性位点或临近部位的数
14、个氨基酸被替换，由此增强了对前体药物的转化能力3。慢病毒载体容纳外源性目的基因的片段大，可以在体内长期表达，免疫反应小，安全性较好4，可以在更多的宿主细胞内生成高滴度的病毒。本研究中携带 HSV1-sr39tk 基因的慢病毒高效感染 GRC-1 细胞，成功建立感染慢病毒 HSV1-sr39tk 的肾癌细胞株GRC-1，为研究 HSV1-sr39tk /ACV 系统促肾癌细胞株 GRC-1 细胞凋亡奠定了实验基础。【参考文献】1 Thust R, Tomicic M, Kl cking R, et al. Cytogenetic genotoxicity of anti-herpes purin
15、e nucleoside analogues in CHO cells KKME-专业医学搜索引擎 http:/ the thymidine kinase gene of herpes simplex virus type 1: comparison of ganciclovir, penciclovir and acyclovir J. Mutagenesis,2000,15(2):177-184.2 Qasim W, Thrasher AJ, Buddle J, et al. T cell transduction and suicide with an enhanced mutant thymidine kinase J. Gene Ther,2002,9(12):824-827.3 Black ME, Kokoris MS, Sabo P. Herpes simplex virus-1 thymidine kinase mutants created by semi-random sequence mutagenesis improve prodrug-mediated tumor cell killing J. Cancer Res,2001,61(7):3022-3026.4 Rubinson DA, D
