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1、基于LAMP技术mecA/ nuc /femB三基因联合MRSA快速检测方法的建立,一、研究背景 二、LAMP技术 三、技术路线 四、前期工作及预期结果,研究背景,研究背景,MRSA分离率逐年增加,研究背景,研究背景,Diekema DJ，et al.Clin Infect Dis.2001;32:S114-32,全球MRSA流行现状,中国CHINET(2010),研究背景,研究背景,MRSA,VRSA,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resisitant staphylococcus aureus, MRSA)指含有mecA基因或者苯唑西林最小抑菌浓度（Minimum in
2、hibitory concentration, MIC）2g的金黄色葡萄球菌菌株。,MRSA的进化历程,90 to 95% of current S. aureus strains are resistant to penicillin About 60 to 70% of strains are resistant to methicillin Two cases of vancomycin-resistant S. aureus were reported.,研究背景,MRSA耐药机制,药物作用靶位的改变,药物灭活酶的产生,细胞壁通透性改变,主动外排泵的作用,研究背景,手术之前进行MRSA
3、筛选可以显著减少手术部位MRSA感染风险,筛查可降低MRSA感染率,住院病人MRSA筛选可以显著减少MRSA的感染与传播,病原菌鉴定方法的比较,头孢西丁纸片法,微量肉汤稀释法,E-test实验,MRSA主要检测方法,PCR法,荧光定量PCR法,环介导的等温扩增技术(loop mediated isothermal amplification ,LAMP)是2000年Notomi 等建立的一种新型体外特异扩增DNA 片段的分子生物学技术。,LAMP 技术,LAMP 技术的原理,目的基因,部分产物结构,62-65度等温反应,最多1小时即可获得特异的结果,LAMP 反应条件及结果,LAMP 技术的优
4、点,灵敏度高,特异性强,反应时间短,所需设备简单,产物检测快捷,LAMP法与PCR法的比较,靶基因的选择,mecA：编码PBP2蛋白,是MRSA 耐药的定性决定性因素；PCR法检测mecA被认为是检测甲氧西林耐药的“金标准”；,nuc ：编码细胞外耐热核酸酶，是葡萄球菌属所特有的保守性基因，检测nuc基因可以有效的区分葡萄球菌属和其它菌属；,femB：是甲氧西林耐药的必须因子，影响mecA基因的表达，在金黄色葡萄球菌中高度保守，并且凝固酶阴性葡萄球菌不表达该基因。,技术路线,一、通过查阅文献获取LAMP法mecA引物序列；,二、通过与军事医学科学院基础医学研究所查磊博士合作利用BIOSUN软件针对nuc和femB基因各设计3对引物，已送公司合成；,三、以我国自主研制、经SFDA批准的MRSA检测试剂盒作为常规标本中MRSA的筛选（已向医院递交新业务开展报告）；,前期工作,前期工作,四、对我院2011年MRSA及其它耐药菌进行统计和分析并保留菌株；,五、实验相关试剂的调研。,预期结果,建立一种基于LAMP技术的MRSA快速检测方法,获得适用于LAMP技术的nuc、femB的引物组合,对适用于LAMP技术的nuc、femB扩增区申请专利进行保护,撰写高质量学术论文2-3篇,
