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1、醋酸纤维素薄膜电泳分离及定量测定血清蛋白成分一、实验目的 1掌握醋酸薄膜电泳的原理及操作。 2定量测定人血清中各种蛋白质的相对百分含量。3掌握分光光度计的原理及操作 二、实验原理采用醋酸纤维薄膜为支持物的电泳方法，叫做醋酸纤维素薄膜电泳。醋酸纤 维素，是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯。将它溶于有机溶剂（如： 丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄 膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，有强渗透性，厚度约为120m 。 醋酸纤维素薄膜电泳是近年来推广的一种新技术。它具有微量、 快速、简便、 分辨力高、 对样品无拖尾和吸附现象等优点。该技术已广泛应用于血清蛋白、糖
2、 蛋白、脂蛋白、结合球蛋白、同功酶的分离和测定等方面。目前，醋酸纤维薄膜 电泳趋向于代替纸电泳。四、试剂和器材（一）试剂（1）新鲜血清 无溶血现象 。（2）巴比妥巴比妥钠缓冲液(pH8.6 ，0.07M，离子强度 0.06) ：称取巴比妥1.66g 和巴比妥钠 12.76g，溶于少量蒸馏水后定容1 000ml。（3）染色液：称取氨基黑 10B 0.5g ，加入蒸馏水 40ml，甲醇 50ml 和冰乙酸10ml，混匀，在具塞试剂瓶内贮存。（4）漂洗液：取 95乙醇 45ml，冰乙酸 ml 和蒸馏水 50ml。混匀，在具塞试剂瓶内贮存。 易挥发、密封 （5）透明液 易挥发、密封 甲液取冰乙酸15m
3、l 和无水乙醇 85ml，混匀，装入试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。 乙液取冰乙酸25ml 和无水乙醇 75ml，混匀，装入试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。 （6）液体石腊。（7）0.4mol 氢氧化钠溶液：称取16g氢氧化钠（分析纯）用少量蒸馏水溶解后定容到 1000ml。（二）器材（1）醋酸纤维素薄膜 2 8 （浙江黄岩曙光化工厂等处生产）（2）培养皿（直径910 ）（3）血色素吸管或点样器（4）直尺和铅笔（5）镊子（6）电泳仪和电泳槽（7）万用电表（8）玻璃板（ 8 12）（9）普通滤纸（10）试管和试管架（11）吹风机 （12）单面刀片（13）擦镜纸（14）吸量管（ 2ml、5ml）和吸量管架（1
4、5）722 型分光光度计五、实验仪器介绍 （1）722型分光光度计测量原理 分光光度法测量的理论依据是伯郎比耳定律：当容液中的物质在光的照射和 激发下，产生了对光吸收的效应。 但物质对光的吸收是有选择性的，各种不同 的物质都有其各自的吸收光谱。 所以根据定律当一束单色光通过一定浓度范围 的稀有色溶液时，溶液对光的吸收程度A与溶液的浓度 c（g/l ）或液层厚度 b(cm)成正比。其定律表达式A=abc （a 是比例系数）。当c 的单位为 mol/l时，比例系数用 表示，则 A= bc 称为摩尔吸光系数。其单位为Lmol-1 cm-1 它是有色物质在一定波长 下的特征常数。 T( 透光率 )=I
5、/I0 A(吸光度 )= -lgT 或 A=KCL( 比色皿 的厚度 ) 测定时，入射光 I, 吸光系数和溶液的光径长度不变时，透过光是 根据溶液的浓度而变化的，即“K”为常数。比色皿厚度一定， “L”、“I0 ” 也一定。只要测出A即可算出“ C ”。 （分光光度计的表头上，一行是透光 率，一行是吸光度。） 722型分光光度计的使用1 、将灵敏度旋钮调至“ 1”档（信号放大倍率最小）。2 、开启电源，指示灯亮，选择开关置于“ T”，波长调至到测试用波长。仪 器预热 20 分钟。3 、 打开试样室（光门自动关闭） ， 调节透光率零点旋钮， 使数字显示为 000.0。 （调节 100%T旋钮），
6、盖上试样室盖，将比色皿 架处于蒸馏水校正位置，使光电管受光，调节透光率100% 旋钮使数字显 示 100.0。如显示不到 100.0 ，则可适当增加微电流放大的倍数。（增加 灵敏度 的档数同时应重复（ 3）调节仪器透光率的“ 0”位）但尽量使倍 率置于低档使用。这样仪器会有更高的稳定性。4 、预热后，按（ 3）连续几次调整透光率的“0”位和“ 100% ”的位置，待稳 定后仪器可进行测定工作。 吸光度“ A”的测量 将选择开关置于 A 。调节吸光度调零旋钮，使得数字显示为零，然后将被测 样品移入光路，显示值即为被测样品的吸光度值。 浓度 c 的测量 将选择开关由“ A”旋至“C”将已标定浓度的
7、样品放入光路，调节浓度旋钮， 使得数字显示为标定值，将被测样品放入光路即可读出被测样品的浓度值。 注意事项1 、测量完毕，速将暗盒盖打开，关闭电源开关，将灵敏度旋钮调至最低档， 取出比色皿，将装有硅胶的干燥剂袋放入暗盒内，关上盖子，将比色皿中 的溶液倒入烧杯中，用蒸馏水洗净后放回比色皿盒内。2 、每台仪器所配套的比色皿不可与其它仪器上的表面皿单个调换。 使用方法 （1）预热仪器将选择开关置于“ T”，打开电源开关，使仪器预热20 分钟。 为了防止光电管疲劳， 不要连续光照， 预热仪器时和不测定时应将试样室 盖打开，使光路切断。 （2）选定波长根据实验要求，转动波长手轮，调至所需要的单色波长。
8、（3）固定灵敏度档在能使空白溶液很好地调到 “100% ”的情况下， 尽可能采 用灵敏度较低的挡，使用时，首先调到“1”挡，灵敏度不够时再逐渐升 高。但换挡改变灵敏度后， 须重新校正“0% ”和“100% ”。选好的灵敏度， 实验过程中不要再变动。 （4）调节 T=0% 轻轻旋动“ 0% ”旋钮，使数字显示为“00.0”，（此时试样 室是打开的）。 （5）调节 T=100% 将盛蒸馏水（或空白溶液，或纯溶剂）的比色皿放入比色 皿座架中的第一格内， 并对准光路， 把试样室盖子轻轻盖上， 调节透过率 “100% ”旋钮，使数字显示正好为“100.0 ”。 （6）吸光度的测定将选择开关置于“ A”，
9、盖上试样室盖子，将空白液置于 光路中，调节吸光度调节旋钮，使数字显示为“.000”。将盛有待测溶液 的比色皿放入比色皿座架中的其它格内，盖上试样室盖， 轻轻拉动试样架 拉手， 使待测溶液进入光路， 此时数字显示值即为该待测溶液的吸光度值。 读数后，打开试样室盖，切断光路。 重复 上述测定操作 1-2 次，读取相应的吸光度值，取平均值。（7）浓度的测定选择开关由 “A ”旋置“C ”，将已标定浓度的样品放入光路， 调节浓度旋钮， 使得数字显示为标定值， 将被测样品放入光路， 此时数字 显示值即为该待测溶液的浓度值。（8）关机实验完毕，切断电源，将比色皿取出洗净，并将比色皿座架用软纸擦净。（2）醋
10、酸纤维素薄膜1 原理 醋酸纤维素薄膜电泳（ cellulose acetate membrance electrophoresis） 以醋酸纤维薄膜为支持物。 它是纤维 素的醋酸酯， 由纤维素的 羟基经乙酰 化而制成。它溶于丙酮等有机溶液中，即可涂布成均一细密的微孔薄膜， 厚度以 0.1mm 0.15mm为宜。太厚吸水性差，分离效果不好；太薄则膜片 缺少应有的机械强度则易碎。 2 应用 醋酸纤维素薄膜电泳操作简单、快速、廉价。已经广泛用于血清蛋白，血 红蛋白，球 蛋白，脂蛋白，糖蛋白，甲胎蛋白，类固醇及同工酶等的分 离分析中 ，尽管它的分辨力比聚丙酰胺凝胶电泳低，但它具有简单，快速 等优点 3
11、 特点 （ 1 ）醋酸 纤维素薄 膜对蛋 白质样品 吸附极 少，无 “拖尾” 现象， 染色后 背 景能完 全脱色 ，各种 蛋白 质染色 带分离 清晰， 因而提 高了测 定的 精确性。（ 2）快速省时。由于醋酸纤维素薄膜亲水性较滤纸小，薄膜中所容纳的缓冲液也较少，电渗作用小，电泳时大部分电流是由样品传导的，所以分离速度快，电泳时间短，一般电泳45 60min 即可，加上染色，脱色，整个电泳完成仅需90min 左右。（ 3）灵敏度高，样品用量少。血清蛋白仅需2 l 血清，甚至加样体积少至 0.1 l ，仅含 5g 蛋白样品也可得到清晰的分离带。临床医学检验利用这一点，检测在病理情况下微量异常蛋白的
12、改变。（ 4）应用面广。某些蛋白在纸上电泳不易分离，如胎儿甲种球蛋白，溶菌酶，胰岛素，组蛋白等用醋酸纤维薄膜电泳能较好地分离。（ 5）醋酸纤维素薄膜电泳染色后，经冰乙酸，乙醇混合液或其它溶液浸泡后可制成透明的干板，有利于扫描定量及长期保存。4 注意事项1、醋酸纤维素薄膜的预处理市售醋酸 纤维素薄膜均为干膜片，薄膜的浸润与选膜是电泳成败的重要关键之一。将干膜片漂浮于电极缓冲液表面，其目的是选择膜片厚薄及均匀度，如漂浮 15s30s 时，膜片吸水不均匀，则有白斑点或条纹，这提示膜片厚薄不匀，应舍去不用，以免造成电泳后区带扭曲，界线不清，背景脱色困难，结果难以重复。由于醋酸纤维薄膜亲水性比纸小，浸泡
13、 30min 以 上是保证膜片上有一定量的缓冲液，并使其恢复到原来多孔的网状结构。最好是让漂浮于缓冲液的薄膜吸满缓冲液后自然下沉，这样可将膜片上聚集的小气泡赶着走。点样时，应将膜片表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免缓冲液太多引起样品扩散。但也不能吸得太干，太干则样品不易进入薄膜的网孔内，而造成电泳起始点参差不齐，影响分离效果。吸水量以不干不湿为宜。为防止指纹感染，取膜时，应戴指套或用镊子。2、缓冲液的选择醋酸纤维素薄膜电泳常选用pH8.6 巴比妥溶液 ，其浓度为0.05mol/L 0.09mol/L。选择何种浓度与样品及薄膜的薄厚有关。选择时，先初步定下某一浓度，如电泳槽两极之间的膜长度为 8
14、cm10cm ，则需电 压25V/cm 膜长，电流强度为0.4mA/cm 0.5mA/cm 膜宽 。当电泳达不到或超过这个值时，则应增加缓冲液浓度或进行稀释。缓冲液浓度过低，则区带泳动速度快，并由于扩散变宽；缓冲液浓度过高，则区带泳动速度慢，区带分布过于集中不易分辨。3、加样量加样品的多少与电泳条件、样品的性质、染色方法与检测手段灵敏度密切相关。作为一般原则，检测方法越灵敏，加样量则越少，对分离更有利。如加样量过大，则电泳后区带分离不清楚，甚至互相干扰，染色也较费时。如电泳后用洗脱法定量时，每厘米加样线上需加样品0.1 l 0.5 l 约相当于5g 1000g 蛋白 。血清蛋白常规电泳分离时，
15、每厘米加样线加样量不超过1l ，相当于 60 g80g 的蛋白质 。但糖蛋白和脂蛋白电泳时，加样量则应多些。对每种样品加样量均应先作预实验加以选择。点样好坏是获得理想图谱的重要环节之一，以印章法加样时，动作应轻、稳，用力不能太重，以免将薄膜弄坏或印出凹陷而影响电泳区带分离效果。4、电量的选择电泳过程应 选择合适的电流强度，一般电流强度为 0.4mA/cm 0.5mA/cm宽膜为宜。电流强度高，尤其在温度较高的环境中，可引起蛋白质变性或由于热效应引起缓冲液中水分蒸发，使缓冲液浓度增加，造成膜片干涸。电流过低，则样品泳动速度慢且易扩散。5、染色液的选择对醋酸纤维 素薄膜电泳后染色应根据样品的特点加
16、以选择。其原则是染料对被分离样品有较强的着色力，背景易脱色；应尽量采用水溶性染料，不宜选择醇溶性染料，以免引起醋酸纤维素膜溶解。应控制染色 时间。时间长，薄膜底色深不易脱去；时间短，着色浅不宜区分，或造成条带染色不均，必要时可进行复染。6、透明及保存透明液应临用前配制，以免冰乙酸及乙醇挥发影响透明效果。这些试剂最好选用分析纯。透明前，薄膜应完全干燥。透明时间应掌握好，如在透明乙液中浸泡时间太长则薄膜溶解，太短则透明度不佳。透明后的薄膜完全干燥后才浸入石蜡中，使薄膜软化。如有水，则体石蜡不易浸入，薄膜不易平展 六、操作方法 一、仪器和薄膜的准备 1醋酸纤维素薄膜的润湿的选择：将薄膜小心地放入盛有缓冲液的培养皿内， 使它漂浮在液面。若迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则表明薄膜质地 均匀；若润湿时，薄膜上出现深浅不一的条纹或斑点等，则为薄厚不匀的 薄膜。实验中应选用质地均匀的薄膜。因为，纤维素薄膜的质量对电泳的 结果影响很大。例如，膜厚薄不均可以造成区带歪
