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1、醋酸纤维素薄膜电泳分离及定量测定血清蛋白成分一、实验目的 1掌握醋酸薄膜电泳的原理及操作。 2定量测定人血清中各种蛋白质的相对百分含量。3掌握分光光度计的原理及操作 二、实验原理采用醋酸纤维薄膜为支持物的电泳方法,叫做醋酸纤维素薄膜电泳。醋酸纤 维素,是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯。将它溶于有机溶剂(如: 丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等)后,涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄 膜。该膜具有均一的泡沫状的结构,有强渗透性,厚度约为120m 。 醋酸纤维素薄膜电泳是近年来推广的一种新技术。它具有微量、 快速、简便、 分辨力高、 对样品无拖尾和吸附现象等优点。该技术已广泛应用于血清蛋白、糖
2、 蛋白、脂蛋白、结合球蛋白、同功酶的分离和测定等方面。目前,醋酸纤维薄膜 电泳趋向于代替纸电泳。四、试剂和器材(一)试剂(1)新鲜血清 无溶血现象 。(2)巴比妥巴比妥钠缓冲液(pH8.6 ,0.07M,离子强度 0.06) :称取巴比妥1.66g 和巴比妥钠 12.76g,溶于少量蒸馏水后定容1 000ml。(3)染色液:称取氨基黑 10B 0.5g ,加入蒸馏水 40ml,甲醇 50ml 和冰乙酸10ml,混匀,在具塞试剂瓶内贮存。(4)漂洗液:取 95乙醇 45ml,冰乙酸 ml 和蒸馏水 50ml。混匀,在具塞试剂瓶内贮存。 易挥发、密封 (5)透明液 易挥发、密封 甲液取冰乙酸15m
3、l 和无水乙醇 85ml,混匀,装入试剂瓶内,塞紧瓶塞,备用。 乙液取冰乙酸25ml 和无水乙醇 75ml,混匀,装入试剂瓶内,塞紧瓶塞,备用。 (6)液体石腊。(7)0.4mol 氢氧化钠溶液:称取16g氢氧化钠(分析纯)用少量蒸馏水溶解后定容到 1000ml。(二)器材(1)醋酸纤维素薄膜 2 8 (浙江黄岩曙光化工厂等处生产)(2)培养皿(直径910 )(3)血色素吸管或点样器(4)直尺和铅笔(5)镊子(6)电泳仪和电泳槽(7)万用电表(8)玻璃板( 8 12)(9)普通滤纸(10)试管和试管架(11)吹风机 (12)单面刀片(13)擦镜纸(14)吸量管( 2ml、5ml)和吸量管架(1
4、5)722 型分光光度计五、实验仪器介绍 (1)722型分光光度计测量原理 分光光度法测量的理论依据是伯郎比耳定律:当容液中的物质在光的照射和 激发下,产生了对光吸收的效应。 但物质对光的吸收是有选择性的,各种不同 的物质都有其各自的吸收光谱。 所以根据定律当一束单色光通过一定浓度范围 的稀有色溶液时,溶液对光的吸收程度A与溶液的浓度 c(g/l )或液层厚度 b(cm)成正比。其定律表达式A=abc (a 是比例系数)。当c 的单位为 mol/l时,比例系数用 表示,则 A= bc 称为摩尔吸光系数。其单位为Lmol-1 cm-1 它是有色物质在一定波长 下的特征常数。 T( 透光率 )=I
5、/I0 A(吸光度 )= -lgT 或 A=KCL( 比色皿 的厚度 ) 测定时,入射光 I, 吸光系数和溶液的光径长度不变时,透过光是 根据溶液的浓度而变化的,即“K”为常数。比色皿厚度一定, “L”、“I0 ” 也一定。只要测出A即可算出“ C ”。 (分光光度计的表头上,一行是透光 率,一行是吸光度。) 722型分光光度计的使用1 、将灵敏度旋钮调至“ 1”档(信号放大倍率最小)。2 、开启电源,指示灯亮,选择开关置于“ T”,波长调至到测试用波长。仪 器预热 20 分钟。3 、 打开试样室(光门自动关闭) , 调节透光率零点旋钮, 使数字显示为 000.0。 (调节 100%T旋钮),
6、盖上试样室盖,将比色皿 架处于蒸馏水校正位置,使光电管受光,调节透光率100% 旋钮使数字显 示 100.0。如显示不到 100.0 ,则可适当增加微电流放大的倍数。(增加 灵敏度 的档数同时应重复( 3)调节仪器透光率的“ 0”位)但尽量使倍 率置于低档使用。这样仪器会有更高的稳定性。4 、预热后,按( 3)连续几次调整透光率的“0”位和“ 100% ”的位置,待稳 定后仪器可进行测定工作。 吸光度“ A”的测量 将选择开关置于 A 。调节吸光度调零旋钮,使得数字显示为零,然后将被测 样品移入光路,显示值即为被测样品的吸光度值。 浓度 c 的测量 将选择开关由“ A”旋至“C”将已标定浓度的
7、样品放入光路,调节浓度旋钮, 使得数字显示为标定值,将被测样品放入光路即可读出被测样品的浓度值。 注意事项1 、测量完毕,速将暗盒盖打开,关闭电源开关,将灵敏度旋钮调至最低档, 取出比色皿,将装有硅胶的干燥剂袋放入暗盒内,关上盖子,将比色皿中 的溶液倒入烧杯中,用蒸馏水洗净后放回比色皿盒内。2 、每台仪器所配套的比色皿不可与其它仪器上的表面皿单个调换。 使用方法 (1)预热仪器将选择开关置于“ T”,打开电源开关,使仪器预热20 分钟。 为了防止光电管疲劳, 不要连续光照, 预热仪器时和不测定时应将试样室 盖打开,使光路切断。 (2)选定波长根据实验要求,转动波长手轮,调至所需要的单色波长。
8、(3)固定灵敏度档在能使空白溶液很好地调到 “100% ”的情况下, 尽可能采 用灵敏度较低的挡,使用时,首先调到“1”挡,灵敏度不够时再逐渐升 高。但换挡改变灵敏度后, 须重新校正“0% ”和“100% ”。选好的灵敏度, 实验过程中不要再变动。 (4)调节 T=0% 轻轻旋动“ 0% ”旋钮,使数字显示为“00.0”,(此时试样 室是打开的)。 (5)调节 T=100% 将盛蒸馏水(或空白溶液,或纯溶剂)的比色皿放入比色 皿座架中的第一格内, 并对准光路, 把试样室盖子轻轻盖上, 调节透过率 “100% ”旋钮,使数字显示正好为“100.0 ”。 (6)吸光度的测定将选择开关置于“ A”,
9、盖上试样室盖子,将空白液置于 光路中,调节吸光度调节旋钮,使数字显示为“.000”。将盛有待测溶液 的比色皿放入比色皿座架中的其它格内,盖上试样室盖, 轻轻拉动试样架 拉手, 使待测溶液进入光路, 此时数字显示值即为该待测溶液的吸光度值。 读数后,打开试样室盖,切断光路。 重复 上述测定操作 1-2 次,读取相应的吸光度值,取平均值。(7)浓度的测定选择开关由 “A ”旋置“C ”,将已标定浓度的样品放入光路, 调节浓度旋钮, 使得数字显示为标定值, 将被测样品放入光路, 此时数字 显示值即为该待测溶液的浓度值。(8)关机实验完毕,切断电源,将比色皿取出洗净,并将比色皿座架用软纸擦净。(2)醋
10、酸纤维素薄膜1 原理 醋酸纤维素薄膜电泳( cellulose acetate membrance electrophoresis) 以醋酸纤维薄膜为支持物。 它是纤维 素的醋酸酯, 由纤维素的 羟基经乙酰 化而制成。它溶于丙酮等有机溶液中,即可涂布成均一细密的微孔薄膜, 厚度以 0.1mm 0.15mm为宜。太厚吸水性差,分离效果不好;太薄则膜片 缺少应有的机械强度则易碎。 2 应用 醋酸纤维素薄膜电泳操作简单、快速、廉价。已经广泛用于血清蛋白,血 红蛋白,球 蛋白,脂蛋白,糖蛋白,甲胎蛋白,类固醇及同工酶等的分 离分析中 ,尽管它的分辨力比聚丙酰胺凝胶电泳低,但它具有简单,快速 等优点 3
11、 特点 ( 1 )醋酸 纤维素薄 膜对蛋 白质样品 吸附极 少,无 “拖尾” 现象, 染色后 背 景能完 全脱色 ,各种 蛋白 质染色 带分离 清晰, 因而提 高了测 定的 精确性。( 2)快速省时。由于醋酸纤维素薄膜亲水性较滤纸小,薄膜中所容纳的缓冲液也较少,电渗作用小,电泳时大部分电流是由样品传导的,所以分离速度快,电泳时间短,一般电泳45 60min 即可,加上染色,脱色,整个电泳完成仅需90min 左右。( 3)灵敏度高,样品用量少。血清蛋白仅需2 l 血清,甚至加样体积少至 0.1 l ,仅含 5g 蛋白样品也可得到清晰的分离带。临床医学检验利用这一点,检测在病理情况下微量异常蛋白的
12、改变。( 4)应用面广。某些蛋白在纸上电泳不易分离,如胎儿甲种球蛋白,溶菌酶,胰岛素,组蛋白等用醋酸纤维薄膜电泳能较好地分离。( 5)醋酸纤维素薄膜电泳染色后,经冰乙酸,乙醇混合液或其它溶液浸泡后可制成透明的干板,有利于扫描定量及长期保存。4 注意事项1、醋酸纤维素薄膜的预处理市售醋酸 纤维素薄膜均为干膜片,薄膜的浸润与选膜是电泳成败的重要关键之一。将干膜片漂浮于电极缓冲液表面,其目的是选择膜片厚薄及均匀度,如漂浮 15s30s 时,膜片吸水不均匀,则有白斑点或条纹,这提示膜片厚薄不匀,应舍去不用,以免造成电泳后区带扭曲,界线不清,背景脱色困难,结果难以重复。由于醋酸纤维薄膜亲水性比纸小,浸泡
13、 30min 以 上是保证膜片上有一定量的缓冲液,并使其恢复到原来多孔的网状结构。最好是让漂浮于缓冲液的薄膜吸满缓冲液后自然下沉,这样可将膜片上聚集的小气泡赶着走。点样时,应将膜片表面多余的缓冲液用滤纸吸去,以免缓冲液太多引起样品扩散。但也不能吸得太干,太干则样品不易进入薄膜的网孔内,而造成电泳起始点参差不齐,影响分离效果。吸水量以不干不湿为宜。为防止指纹感染,取膜时,应戴指套或用镊子。2、缓冲液的选择醋酸纤维素薄膜电泳常选用pH8.6 巴比妥溶液 ,其浓度为0.05mol/L 0.09mol/L。选择何种浓度与样品及薄膜的薄厚有关。选择时,先初步定下某一浓度,如电泳槽两极之间的膜长度为 8
14、cm10cm ,则需电 压25V/cm 膜长,电流强度为0.4mA/cm 0.5mA/cm 膜宽 。当电泳达不到或超过这个值时,则应增加缓冲液浓度或进行稀释。缓冲液浓度过低,则区带泳动速度快,并由于扩散变宽;缓冲液浓度过高,则区带泳动速度慢,区带分布过于集中不易分辨。3、加样量加样品的多少与电泳条件、样品的性质、染色方法与检测手段灵敏度密切相关。作为一般原则,检测方法越灵敏,加样量则越少,对分离更有利。如加样量过大,则电泳后区带分离不清楚,甚至互相干扰,染色也较费时。如电泳后用洗脱法定量时,每厘米加样线上需加样品0.1 l 0.5 l 约相当于5g 1000g 蛋白 。血清蛋白常规电泳分离时,
15、每厘米加样线加样量不超过1l ,相当于 60 g80g 的蛋白质 。但糖蛋白和脂蛋白电泳时,加样量则应多些。对每种样品加样量均应先作预实验加以选择。点样好坏是获得理想图谱的重要环节之一,以印章法加样时,动作应轻、稳,用力不能太重,以免将薄膜弄坏或印出凹陷而影响电泳区带分离效果。4、电量的选择电泳过程应 选择合适的电流强度,一般电流强度为 0.4mA/cm 0.5mA/cm宽膜为宜。电流强度高,尤其在温度较高的环境中,可引起蛋白质变性或由于热效应引起缓冲液中水分蒸发,使缓冲液浓度增加,造成膜片干涸。电流过低,则样品泳动速度慢且易扩散。5、染色液的选择对醋酸纤维 素薄膜电泳后染色应根据样品的特点加
16、以选择。其原则是染料对被分离样品有较强的着色力,背景易脱色;应尽量采用水溶性染料,不宜选择醇溶性染料,以免引起醋酸纤维素膜溶解。应控制染色 时间。时间长,薄膜底色深不易脱去;时间短,着色浅不宜区分,或造成条带染色不均,必要时可进行复染。6、透明及保存透明液应临用前配制,以免冰乙酸及乙醇挥发影响透明效果。这些试剂最好选用分析纯。透明前,薄膜应完全干燥。透明时间应掌握好,如在透明乙液中浸泡时间太长则薄膜溶解,太短则透明度不佳。透明后的薄膜完全干燥后才浸入石蜡中,使薄膜软化。如有水,则体石蜡不易浸入,薄膜不易平展 六、操作方法 一、仪器和薄膜的准备 1醋酸纤维素薄膜的润湿的选择:将薄膜小心地放入盛有缓冲液的培养皿内, 使它漂浮在液面。若迅速润湿,整条薄膜色泽深浅一致,则表明薄膜质地 均匀;若润湿时,薄膜上出现深浅不一的条纹或斑点等,则为薄厚不匀的 薄膜。实验中应选用质地均匀的薄膜。因为,纤维素薄膜的质量对电泳的 结果影响很大。例如,膜厚薄不均可以造成区带歪