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1、生物技术制药第四章 抗体制药第四章 抗体制药第一节 概述 第二节 单克隆抗体 第三节 鼠源性单克隆抗体的改造 第四节 基因工程抗体和抗体工程 第五节 抗体诊断试剂 第六节 抗体治疗药物第一节 概述1890年：Behring和北里柴三郎等发现了白喉抗毒素，并 建立了血清疗法，开抗体制药之先河。 1937年：Tiselius等人用电泳法将血清蛋白分为白蛋白、 甲种（）球蛋白、乙种（ ）球蛋白和丙种（ ）球 蛋白，并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分。 20世纪60年代初期：抗原决定簇，精制单价血清。 1975年：Khler和Milstein等，单克隆抗体，其具有高度 特异性、均一性，以及来源稳定
2、可大量生产等特点。 1984年：人-鼠嵌合抗体 1984年至今：单克隆抗体的鼠源性及分子过大的问题得 以解决，可仅作为与抗原特异性结合试剂。单克隆抗体的应用用于疾病的诊断和治疗：如利用单克隆抗体检测 与某些疾病相关的抗原，辅助临床诊断，或用放 射性核素标记 单克隆抗体进行肿瘤显像，进行 免疫鉴定。用于临床治疗，如针对T淋巴细胞共 有的分化抗原CD3的单克隆抗体，用作免疫抑制 剂。 单克隆抗体还可作为载体制备导向药物。但是要 解决以下两个问题：（1）鼠源性单克隆抗体的 免疫原性；（2）完整的抗体分子分子量过大， 难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度 。单克隆抗体的应用 基因工程技术为解决这
3、两个问题提供了可能 。 已通过基因工程技术，制备出改形抗体、单 链抗体、单域抗体、最小识别单位等很多类 型的抗体或抗体单位。基本消除了单克隆抗 体的鼠源性，相对分子质量只有完整抗体分 子的1/801/3，而且鼠源性单克隆抗体的生 物学活性如激活补体、促进吞噬功能（免疫 调理）、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用等 ，只保留同抗原特异性结合的活性。第二节 单克隆抗体单克隆抗体是将抗体产生细胞与骨髓瘤 细胞融合，通过有限稀释法及克隆化使 杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而 生产的。由于这种抗体是针对一个抗原 决定簇的抗体，又是单一的B淋巴细胞克 隆产生的，因此称为单克隆抗体。它是 结构和特异性完全相同的
4、高纯度抗体。 制备的一般流程见下图。单克隆抗体和 多克隆抗体的 制备抗原脾B淋巴细胞融合融合淋巴细胞骨髓瘤细胞克隆1克隆2克隆3克隆4第二节 单克隆抗体一、抗原与动物免疫 二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养 三、筛选阳性克隆与克隆化 四、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定 五、单克隆抗体的大量制备 六、单克隆抗体的纯化一、抗原与动物免疫（1）制备用于动物免疫的适当抗原。 化学合成抗原，如精制的地高辛。 多数情况下抗原物质只能得到部分纯化，甚至 是极不纯的混合物，如部分纯化的干扰素。 通过克隆化选出最适当的单克隆抗体。 在制备恶性肿瘤细胞表面抗原的单克隆抗体时 ，情况较复杂，需用整个肿瘤细胞做为免疫原
5、 ，经过筛选、克隆化，制备出仅存在于肿瘤细 胞而不存在于正常细胞上的表面标志分子上的 单克隆抗体。一、抗原与动物免疫 （2）稳定的杂交瘤的获得 因免疫动物品系和骨髓瘤细胞在种系发生上距离 越远，产生的杂交瘤越不稳定，故一般采用与骨 髓瘤供体同一品系的动物进行免疫。目前常用的 骨髓瘤细胞系多来自BALB/c小鼠和Lou大鼠，因 此免疫动物也多采用相应的品系，最常用的也是 BALB/c小鼠。 选择动物时应考虑到动物品系的免疫应答基因（ Ir）对抗原免疫应答的影响。不同品系的小鼠与 大鼠在对某类抗原的免疫应答上是不同的。书中 表4-1是骨髓瘤细胞系一览表，可以参考。一、抗原与动物免疫（3）免疫方法：
6、体内免疫法和体外免疫法 体内免疫法：适用于免疫原性强、抗原量较多时应用， 一般用812周龄的雌性鼠。颗粒性抗原（如细菌、细胞 抗原）的免疫原性强，可不加佐剂，直接注入腹腔107 个细胞进行初次免疫，间隔13周，再追加免疫12次， 可溶性抗原则按每只小鼠10100g抗原与福氏完全佐剂 等量混合后注入腹腔内，进行初次免疫，间隔24周， 再用不加佐剂的原抗原追加免疫12次。一般在采集脾 细胞前3日由静脉注射最后一次抗原，其目的是使对应 的B淋巴细胞克隆受到可靠的最大限度的刺激，使其迅 速地增殖分裂，因为细胞融合后增殖最好的细胞是迅速 分裂的细胞。有人认为在常规免疫的基础上用脾内免疫 法做追加免疫较佳
7、。一、抗原与动物免疫 （3）免疫方法：体内免疫法和体外免疫法 体外免疫法：用于不能采用体内免疫法的情况下 ，如制备人源性单克隆抗体，或者抗原的免疫原 性极弱且能引起免疫抑制时使用。 体外免疫法所需要的抗原量少，一般只需几个g ，免疫期短，仅45天，干扰因素少，已成功制 备出针对多种抗原的单克隆抗体，但融合后产生 的杂交瘤细胞株不够稳定。其基本方法是用48 周龄BALB/c小鼠的脾脏制成单个细胞悬液，再 加入适当抗原使其浓度达0.55 g/ml，在5%CO2 、37下培养45天，再分离脾脏细胞，进行细 胞融合。二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养 （1）细胞融合基本方法：取适量脾细胞（1108）
8、与骨 髓瘤细胞（2 107 3107）进行混合，在聚乙二醇（ PEG）作用下诱导它们融合，时间控制在2min以内，然 后用培养液将PEG融合液缓慢稀释。 （2）用于融合的骨髓瘤细胞应具备条件：融合率高， 自身不分泌抗体，所产生的杂交瘤细胞分泌抗体的能力 强且长期稳定等特点。书中表4-1列举了主要的骨髓瘤 细胞系，其中SP2/0、P3.653细胞本身不分泌抗体，细胞 融合后产生的杂交瘤细胞只分泌均一的、完全来自脾细 胞的抗体分子，它们是目前较为理想的可供融合的骨髓 瘤细胞。特别是SP2/0细胞系还具有容易培养、融合率 高等特点，被国内外多个实验室广泛采用。二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养（3
9、）诱导剂PEG的影响：PEG分子量以及浓度 越大，促融率越高。但其粘度和对细胞的毒性也 随之增大。目前常用的PEG的浓度为40%50%， 相对分子质量以4000为佳。但相对分子量 4006000，浓度在10%50%范围之间的PEG都能 使细胞融合。为了提高融合率，在PEG溶液中加 入二甲基亚砜(DMSO），以提高细胞接触的紧 密性，增加融合率。但是，PEG和DMSO都对细 胞有毒性，必须严格限制它们和细胞的接触时间 ，可通过低速离心5min使细胞接触更为紧密，然 后用新配制的培养液来稀释药物并洗涤细胞。二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养（4）培养基的正确选择：常用的选择培养基为 HAT培养基
10、，它是次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（ A）和胸腺嘧啶（T）配制的。其中氨基喋呤（ A）能阻断DNA合成的主要途径，瘤-瘤融合细 胞和瘤细胞因不能合成DNA而死亡。脾-脾融合 细胞和瘤细胞在这样的条件下，几天内亦迅速 死亡。由于SP2/0等骨髓瘤细胞都是次黄嘌呤（ H）鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT）缺乏株， 脾细胞中却有这种酶，因此脾-瘤融合的杂交瘤 细胞可利用HGPRT酶，用次黄嘌呤（H）和胸 腺嘧啶（T）合成DNA，使杂交瘤细胞得以生长二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养（5）选择性培养方法：通常将融合的细胞悬浮 于HAT的培养液（配方见书中表4-2），加入到 含有饲养细胞的96孔板内，根据
11、情况每23天换 液一次。换液时吸去1/22/3培养液，加入等量的 新鲜培养液。在融合后7天内用HAT培养液，杀 死瘤-瘤融合细胞后，第714天改用HT培养液， 14天以后用普通的RPMI1640 完全培养液（配方 书中表4-3），从融合后89天就可对所有克隆生 长孔的培养上清进行抗体检测，筛选出产生抗体 的阳性克隆。二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养（6）饲养细胞： 由于在最适的条件下大约有105个脾细胞才能形 成一个杂交瘤细胞，大量瘤细胞在HAT培养液中 相继死亡，单个或少数的杂交瘤细胞多半不能存 活，所以通常要加入饲养细胞才能使其繁殖。 常用的饲养细胞有小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞和 胸腺细
12、胞等。一般认为饲养细胞能释放某些生长 刺激因子，并能满足杂交瘤细胞对细胞密度的依 赖性。小鼠腹腔巨噬细胞还能清除死亡细胞，故 应用的较多。三、筛选阳性克隆与克隆化（1）筛选阳性克隆： 因为产生特定抗原的抗体产生细胞只占所有脾细胞的 5%左右，所以要进行每孔培养上清的抗体活性的筛选 工作，以选择出阳性克隆，然后进行克隆化培养。 为了尽快地筛选出阳性克隆，必须采用微量、快速、特 异、敏感、简便并一次能检测大批标本的方法。常用的 检测方法有免疫酶技术、免疫荧光技术和放射免疫技术 等。一般来说，免疫酶技术和放射免疫技术均适用于可 溶性抗原及颗粒性抗原的抗体检测。免疫荧光技术适用 于细胞抗原的抗体检测，
13、特别是制备以检测患者活检组 织标本为目的的抗体时，免疫荧光法更有意义，在筛选 抗体的同时，还能对所识别的抗原进行定位判定。1、精制破伤风毒素抗原（ ）吸附（约10g/ml，4，3h）洗涤2、加杂交瘤培养上清液（ ） （4，1h）3、加辣根过氧化物酶标记的羊 抗鼠抗体（ ） （4，1h）洗涤洗涤4、加酶作用底物，呈色孔为阳 性克隆孔ELISA用于破伤风抗体的筛选三、筛选阳性克隆与克隆化（2）克隆化有限稀释法和软琼脂法 筛选出来的阳性克隆中，可能含有不分泌抗体的细胞或 有多株分泌抗体的细胞 ，而且刚刚融合获得的杂交瘤 细胞不稳定，染色体容易丢失，因此应尽早克隆化。 一般融合后获得的 杂交瘤细胞要经
14、过大约3次的克隆化 ，才能达到100%孔内均为抗体阳性细胞克隆。常用的 克隆化方法有有限稀释法和软琼脂法。 有限稀释法是把杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到96孔细 胞培养板中，使每个孔中在理论上只含有一个细胞。第 一次克隆化时也要应用HT培养液，以后的克隆化可用 不含HT的RPMI1640培养液。由于单个细胞难以存活， 克隆化时也需加入饲养细胞辅助其生长。三、筛选阳性克隆与克隆化 （2）克隆化有限稀释法和软琼脂法 软琼脂法是在培养液中加入0.5%左右的琼脂糖 凝胶，细胞分裂后形成小球样团块，由于培养基 是半固体状态，可用毛细吸管将小球吸出，团块 打碎后，移入96孔板中继续培养。用这种方法可 以吸出
15、大量克隆细胞进行培养，因初代细胞很不 易增殖，所以用软琼脂法进行克隆化容易成功。四、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定 （1）杂交瘤细胞的鉴定 正常鼠的脾细胞染色体数为40，全部是端着丝 粒染色体。小鼠骨髓瘤细胞的染色体数变异较 大，SP2/0细胞为6268，NS-1细胞为5464，大 多数为非整倍性，并且有中部着丝点染色体和 亚中部着丝点染色体。杂交瘤细胞的染色体在 数目上接近两种亲本细胞染色体数目的总和， 在结构上除多数为端着丝粒染色体外，还应出 现少数标志染色体。 染色体数目较多又比较集中的杂交瘤细胞能稳 定分泌高效价的抗体，而染色体数目少且比较 分散的杂交瘤细胞分泌抗体的能力较低。四、杂交瘤细
16、胞与抗体性状的鉴定 （2）抗体性状的鉴定 由于不同类和不同亚类的免疫球蛋白生物学特性 差异较大，诸如补体活化、免疫调理、ADCC效 应等等，因此要对制备的杂交瘤细胞产生的单克 隆抗体，进行Ig类和亚类的鉴定，可用羊或兔抗 Ig不同类和亚类的抗体，进行免疫扩散或ELISA 法来鉴定。在单克隆抗体鉴定中还必须进行亲和 力测定，它可为正确选择不同用途的单克隆抗体 提供依据。另外根据需要不同，还应对单克隆抗 体的特异性、纯度和识别抗原的相对分子量等进 行测定。五、单克隆抗体的大量制备 （1）体外培养法可获得10g/ml的抗体；（2）动物体 内诱生法，可获得520mg/ml的抗体。目前多采用后者 生产制备单克隆抗体。因为杂交瘤细胞的两种亲本细胞 均来自BALB/c小鼠，所以应选用BALB/c小鼠来制备单 克隆抗体。 为了使杂交瘤细胞在腹腔内增殖良好，可于注入细胞的 几
