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1、生化分析仪的常用检测方法生化分析仪的常用检测方法董苹2010-8内容 一 概述 二 基本原理终点法 三 检测方法 固定时间法连续监测法 功能特点 特点：自动化机械化的仪器设备模仿 代替手工操作 优点：提高了工作效率减少了主观误差 灵敏 准确 快速 标准化分类管道连续流动式 按结构原理分 分立式常用离心式干片式急诊常用 小型 按测定速度分 中型大型超大型（模块式） 按自动化程度分 半自动全自动主要构成 加样系统（样品转盘 试剂仓 取样装置） 比色系统（光源 比色杯 单色器 检测器） 供排水系统 数据处理系统内容 一 概述 二 基本原理终点法 三 检测方法 固定时间法连续监测法 基本原理 临床生化
2、分析仪最常使用的是分光光 度法 分光光度法是通过测定被测物质在特 定波长处或一定波长范围内光的吸收度， 对该物质进行定性和定量分析的方法。分光光度计分光光度计组成光源光源样品池样品池单色器单色器检测器检测器记录装置记录装置光吸收曲线 溶液对不同波长光的吸收程度，通常用 光吸收曲线来描述。讨论 不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状 相似max不变。而对于不同物质，它们的 吸收曲线形状和max则不同。 不同浓度的同一种物质，在某一定波长下 吸光度 A 不同，在max处吸光度A 的差异 最大。此特性可作为物质定量分析的依据 。在分光光度法中, 以_为纵坐标, 以 _为横坐标作图可得光吸收曲线。浓度不
3、同的同种溶液, 在该种曲线中其最大吸收波长_，相应的吸光度大小则_，同一波长下摩尔吸数 。波长不同相同吸光度相同Lamber-Beer定律：吸收光谱法基本定律描述物质对单色光吸收强弱与液层厚度和 待测物浓度的关系 Lamber定律：AlBeer定律：A C入射光强度I0透射光强度I物体截面为S厚度为lLambert-Beer（朗伯-比尔）定律 当一束平行单色光通过均匀的非散射样品 时，样品对光的吸光度与样品的浓度及厚 度成正比 A = kcb A-吸光度 k-吸光系数 c-溶液浓度 b-液层厚度吸光度 透光度的负对数 表示物质对光的吸收程度A=-lgT=lg1/T=lgI0/ItT-透光度 I
4、0-入射光强度 It-透射光强度 T=It/I0吸光系数 定义：吸光物质在单位浓度及单位厚度时测得的吸光度。 K值的大小取决于吸光物质的性质、入射光波长、溶液温度和溶剂性质等，与溶液浓度大小和液层厚度无关。但K值大小因溶液浓度所采用的单位的不同而异。 吸光系数 三种表现形式：摩尔吸光系数吸光系数a百分吸光系数E1%1cmLambert-Beer（朗伯-比尔）定律 郎伯-比尔定律表明：当液层厚度固定时， 溶液的吸光度与溶液的浓度成正比。即：A/C=const 故：只要测出某种溶液的吸光度，将它与 已知浓度的标准溶液吸光度进行比较，就 可以算出该溶液的浓度。讨论：1.Lamber-Beer定律的适
5、用条件（前提）: 入射光为单色光 溶液是均匀，无散射溶液 2.该定律适用于固体、液体和气体样品 3.在同一波长下，各组分吸光度具有加和性如果溶液中同时存在两种或两种以上的吸光性物质,则测得的该溶液的吸光度等于溶液中各吸光性物质吸光度的总和，即：A（a+b+c）AaAbAc 应用：多组分测定偏离Beer定律的因素 依据Beer定律,A与C关系 应为经过原点的直线 偏离Beer定律的主要因素 表现为以下两个方面： （一）光学因素 （二）化学因素 （一）光学因素1非单色光的影响：Beer定律应用的重前提入射光为单色光 照射物质的光经单色器分光后并非真正单色光 其波长宽度由入射狭缝的宽度和棱镜或光栅的
6、分辨率决定 为了保证透过光对检测器的响应，必须保证一定的狭缝宽度 这就使分离出来的光具一定的谱带宽度讨论入射光的谱带宽度严重影响吸光系数和吸收光谱形状E1E2 A=E1CLE1E2 A与C不成线性关系，偏离Beer定律（E2-E1) A与C偏离线性关系越严重 结论： 选择较纯单色光（，单色性） 选max作为测定波长（一）光学因素2. 杂散光的影响 杂散光是指从单色器分出的光不在入射光谱带宽度范围内，与所选波长相距较远。 杂散光来源：仪器本身缺陷；光学元件污染造成 杂散光可使吸收光谱变形，吸光度变值。（一）光学因素3反射光和散色光的影响： 反射光和散色光均是入射光谱带宽度内的光直接对T产生影响。
7、 散射和反射使T，A，吸收光谱变形注：一般可用空白对比校正消除 4非平行光的影响： 使光程，A，吸收光谱变形（二）化学因素 溶液中的溶质可因 c 的改变而有离解、 缔合、配位以及与溶剂间的作用等原因而 发生偏离 L-B 定律的现象 。 例：在水溶液中，Cr()的两种离子存在如下平衡 Cr2O42- + H2O 2CrO42- + 2H+ 定量分析方法 (1) 标准曲线法 (2) 标准溶液对比法（外标一点法） (3) 吸光系数法标准曲线法最经典方法 前提：固定仪器和固定条件 过程：配置标准溶液系列 分别测定 A得CA曲线 样品 测定A样 查得C样标准曲线法标准溶液对比法在相同的条件下，配制浓度为
8、cs的标准溶液和浓度为cx的试样溶液，在最大吸收波 长处，分别测定二者的吸光度值为As、Ax ，依据朗伯-比尔定律得: As=Kbcs Ax=Kbcx则: cx = cs*Ax /As标准溶液对比法吸光系数法吸光系数法又称绝对法，是直接利用朗伯- 比尔定律的数学表达式AKbc进行计算的 定量分析方法。在手册中查出待测物质在 最大吸收波长 处的吸光系数 或 , 并在相同条件下测量样品溶液的吸光度A， 则其浓度为：或内容 一 概述 二 基本原理终点法 三 检测方法 固定时间法连续监测法 终点法 终点法通过检测终点吸光度的改变大 小来求出被测物含量。 何为终点？如何判断？ 通常在反应终点附近连续选择
9、两个吸光度 值，求其平均值，根据两点的差值来判断 反应终点。终点法 终点时间的确认： 一、根据时间-吸光度曲线 如:Trinder反应测尿酸，反应曲线上3-5 分钟 时其A趋向稳定,故可将5分钟作为反 应终点。 二、根据被测物反应终点，结合干扰物的 反应 情况来确定如:溴甲酚绿法测血清白蛋白 分类 终点法：一点终点法二点终点法免疫比浊法双波长法一点终点法 一点终点法在时间-吸光度曲线上吸光 度不再改变时，选择一个时间点测定吸光 度值。 通常在反应终点附近连续读两个吸光度， 求出两点的平均值，并根据两点的差值判 断反应是否达到平衡。一点终点法的设置： 以R和S混合之前的空气空白、水空 白或 试剂
10、空白的吸光度值为测定计算基点，以 反应达到平衡的吸光度读数减去空白读数 ，校准曲线通过零点且成直线，对于反应 速度快的多用。如：GLU TG CH等*37AlT （时间）AS+R(吸光度）一点终点法反应曲线 计算公式：C=(Am-Ab)*KAm-终点读数点的吸光度Ab-试剂空白吸光度K-校正系数二点终点法 第二试剂加入以前，选择某一点读取吸光 度Am，经过一定时间后反应达终点后测 第二个吸光度值An,利用两吸光度之差计 算结果。 第一点吸光度值由样本本身或第一试剂与 样品的非特异性反应有关，相当于样品空 白，可有效的消除样品自身的吸光度，如 溶血，黄疸，脂血等的干扰。*40AnTAR2AmS+
11、R1(吸光度）（时间）两点终点Ax=样本空白An - k0 Am（体积校正因子）k0 =Sv+Rl Sv+R1+R2两点终点法 计算公式：C=(An-K0*Am)*KK0-体积校正因子K0=(Sv+R1)/(Sv+R1+R2)免疫比浊法通过物质对光的散射或透射来测定物质含量的 方法：散射比浊：特定蛋白分析仪透射比浊：自动生化分析仪通常作两点终点法分析，多采用多点校准。应用：用Ab测定Ag（主要为微量蛋白：IG、 C、APOA1/B、ASO、RF、CRP等），要求Ab 过量，此时Ag-Ab复合物的生成量随Ag的增加 而递增，光散/透射射强度与抗原量成正比。免疫比浊法 优点： 方法简便 结果准确可
12、用于自动化仪器检测 缺点：抗体用量大达平衡时间长双波长法消除样品中对测定有干扰的物质的影响； 在试样中含有两个组分a和b时，若要测定 组分b,组分a有干扰，应设法消除组分a的 吸收干扰。首先选择待测组分b的最大吸 收波长1作为测量波长，然后用作图的方 法选择参比波长2 ，使组分a在这两个波 长处的吸光度相等。双波长法 试样溶液在2和1两个波长处的吸光度之差，只 与待测组分的浓度成正比，而与干扰组分的浓度 无关干扰物质1.脂血：吸收光谱300600nm呈下降趋势 2.Hb：350nm、400nm、540nm、580nm 吸收峰 3.胆红素：300500nm有吸收峰可见它们的吸收峰都较宽，且同测定
13、波长 有重叠现象。双波长法 主波长的选择 反应体系中待测组分吸收峰对应的波长， 尽量避开或减少来自试剂空白和样本空白 对测定组分的干扰，提高特异性和灵敏度 。双波长法 辅助波长的选择：根据测定波长选择辅助波长，要求干扰物 质在测定波长同辅助波长有相同的吸光度 ，待测物吸光度差异很大。如:钼酸铵法测P3用340nm，而Hb在340 及380nm均有较高吸收峰，选380nm作为 辅助波长。双波长法 双波长测定优点 ：消除噪音干扰减少杂散光影响减少样品本身光吸收的干扰 固定时间法 指在时间-吸光度曲线上选择两个测光点， 这两点既非反应初始吸光度亦非终点吸光 度，利用这两点吸光度差值计算结果。如：苦味酸法测肌酐 固定时间法 计算公式：C=(A2-A1)*KA1A2T(吸光度）连续监测法 根据反应速度与待测物的浓度成正比，通 过测定一段时间内吸光度的变化速率（ A/min ）来计算待测物的浓度。 酶活性测定常用酶促反应曲线连续监测法零级反应期-酶促反应速度达到并保持恒 定速率进行反应，单位时间内的变化速率 恒定不变。在零级反应期单位时间内的吸光度变化(反 应速率A/min)与酶活力呈正比。连续监测法 测定
