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1、第三章 动物细胞工程制药微生物与生化制药实验室张革第一节 概述一、动物细胞工程的发展简史1907年，Harrison首先培养了神经管 区细胞，并观察到从中长出的轴突细 胞(神经纤维)，他的工作被认为是动 物细胞培养开始的标志。1911年，Carrel发现了鸡胚浸出液对 于细胞培养的生长促进作用，并首次 把无菌技术引入细胞培养技术中。1950年后Earle等分别建立了Hela等多 种细胞系(cell line)动物细胞培养从50年代起步，已成为普遍技术新的核酸技术，免疫，电泳等技术使细胞培养技 术从细胞水平进入分子水平1986年，传代细胞Namalwa（Burkitts 淋巴瘤细胞） 生产的干扰
2、素批准临床猴肾细胞Vero生产疫苗1987年，杂交瘤细胞生产抗体1988年后，传代细胞生产基因工程产品t-PA、EPO 、VIII二、动物细胞工程制药的基本概念（一）动物细胞工程制药目前全世界生物技术药物中使用动物细胞工程生 产的已超过80% ，例如蛋白质、单克隆抗体、疫苗等动物细胞工程制药包括：培养细胞获得多肽和蛋白药物转基因动物生产疫苗，多肽和蛋白药物动物细胞培养的产物 疫苗人小儿麻痹症疫苗、狂犬疫苗、风疹疫苗、脑炎疫 苗、疱疹疫苗等动物牛病毒性腹泻疫苗、牛痢疾疫苗、犬传染性肝炎 疫苗、鸡痘病疫苗、猪霍乱疫苗、牛疫狂犬疫苗 、 单克隆抗体IgG、IgM、IgA等免疫调节剂-细胞生长因子、I
3、NT、白细胞活化因子、血清 胸腺因子、IL、胸腺素、巨噬细胞毒力因子等酶uPA、Asn酶、胶原酶、P450、纤维蛋白溶酶原激 活剂、胃蛋白酶、胰蛋白酶、Tyr脱羟酶等激素HCG、EPO、促滤泡激素、GH、促间质细胞激素、 促黄体激素等动物细胞工程制药所涉及的主要技术领域包括细 胞融合技术、细胞核移植技术、动物细胞反应器 ，动物克隆，染色体改造，基因转移，转基因动 物技术和细胞大规模培养技术等方面最基本的有细胞融合技术、转基因动物技术和细 胞大规模培养技术三项技术第二节 动物细胞的体外培养（一）动物细胞的类型1. 贴壁依赖性细胞:包括成纤维细胞型，上皮细胞型。生长于支持物表面。上皮细胞型成纤维细
4、胞型2. 非贴壁依赖性也称悬浮细胞这类细胞培养时不贴附于 支持物上，可在培养液中 悬浮生长。来源于血液、 淋巴组织，许多肿瘤细胞 等均属于此类。细胞一般 呈圆形。 悬浮细胞3.兼性贴壁细胞有些细胞呈现双重性，既可以贴壁生长，也可 以悬浮培养。如中国仓 鼠卵巢细胞，小鼠L929细胞。兼性贴壁细胞（二）动物细胞培养的环境条件1.温度37, 25-28。2.Ph。7.2-7.4 酚红3. 通氧量，需CO24.防治污染。支原体、抗生素。5.基本营养物质6.渗透压（三）动物细胞的培养特征1.比微生物细胞大，无细胞壁，抗机械强度低，对剪切力敏感，适应环境能力差。2.倍增时间长，生长缓慢，易污染，培养时添加
5、抗生素3.培养基要求高，易污染。4.培养过程中细胞相互粘连以集群形式存在。5.产物分泌性6.蛋白后修饰动植物细胞培养与微生物培养性能的相比项项目哺乳动动物细细胞植物细细胞微生物细细胞大小m悬悬浮生长长营营养要求倍增时间时间 h 细细胞分化环环境的敏感性产产物存在产产物浓浓度（%）产产物种类类10100可以，多采用贴贴壁很复杂杂15100有非常敏感胞内或胞外低疫苗、激素、抗体、生长长因子、免疫调节剂调节剂 等10100可以，但细细胞易聚集复杂杂15100有限分化敏感胞内低酶、生物碱、天然色素、有机化合物等110可以简单简单0.55无一般胞内或胞外高发发酵食品、抗生素、有机化合物、酶细胞培养基本技
6、术1.原代培养p（1）组织块培养法p（2）单层细胞培养法动物胚胎或幼龄动物 的组织、器官胰蛋白酶剪碎单个细胞加培养液制成细胞 悬浮 液10代 细胞部分细胞“癌变” ，无限传代动物细胞培养不能 最终培养成动物体50代细胞原代培养传代培养细胞贴壁剥离、分瓶细胞株细胞细胞系2.传代培养3.克隆培养饲养细胞细胞的冻存与复苏l在70以下时，细胞内的酶活性均己停止， 即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。l液氮-196l低温保存的关键：在于通过0-20阶段的处 理过程。 在此温度范围内，水晶呈针状，极易招致 细胞的严重损伤。 冻存和复苏的原则：慢冻快融p当细胞冷到零度以下：形成冰晶。p如果缓慢冷冻，逐步
7、脱水，不致产生大的冰晶p复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即 冰晶的重结晶。p常用的低温保护剂是DMSO，提高胞膜对水的通透性， 降低冰点，减少胞内冰晶，第三节 动物细胞的培养一、动物细胞的营养要求环境适应力最差，培养时间长，营养要求高培养特点：p（1）碳源为葡萄糖p（2）氮源为氨基酸p（3）添加小牛血清和动物胚胎浸出液二、动物细胞的培养条件1.温度p哺乳动物细胞最佳温度：370.5p昆虫细胞最佳温度：272.pHp细胞培养最适pH：7.2-7.4p低于6.8或高于pH7.6细胞退变或死亡p加入缓冲系统：保持培养环境的pH稳定p培养时空气，CO2等进行PH调节p酚红做指示剂3.氧p5
8、% CO2的混合气体4.防止污染：十分重要p培养时间长，培养基营养丰富p小牛血清的支原体污染l解决：p严格灭菌p抗生素：青霉素，链霉素，卡那霉素等三、动物细胞的培养基1.平衡盐溶液(balance saline solution, BSS)p生理平衡盐溶液，与生理的PH，渗透压等一致。p用于洗涤细胞p常用的有Hanks液，Earle液，HEPES溶液等2.合成细胞培养基(sythetic)1950年，Morgen第一个合成培养基：199培养基已经商品化的基本合成培养基有199、MEM、RPIM 1640、DMEM等优点：成分明确，组分稳定，可大量生产基本组分 基本培养基包括四大类物质：l氨基酸
9、；维生素；碳水化合物；无机盐氨基酸l至少含有上述13种氨基酸Eagle MEM培养基l最多含21种氨基酸199培养基l12种必需氨基酸:缬、亮、异亮、苏、赖、色、苯 丙、蛋、组、酪、精氨酸、胱氨酸(L型)l谷氨酰胺(glutamine)： 缺乏可导致细胞生长不 良甚至死亡。在溶液中很不稳定，4下放置1周 可分解50%维生素l脂溶性维生素：(A、D、E、K)常从血清中得到补 充。l水溶性维生素：包括生物素、叶酸、烟酸、烟酰 胺、泛酸、吡哆醇、 吡哆醛、偏多酸钙、核黄素 (B2) 、硫胺素(B1) B12、Vc、胆碱、肌醇和对氨 基苯甲酸。3.天然培养基(nature medium)动物体液或组织
10、提取成分做培养液血清最为常用 ：牛血清、马血清、兔血清l胎牛血清：取自剖腹产的胎牛；胎牛血清是品质最高 的，因为胎牛还未接触外界，血清中所含的抗体、补 体等对细胞有害的成分最少。l新生牛血清：取自出生24 h之内的新生牛；l小牛血清：取自出生10-30 d的小牛维持液生长液目前重点开发的无血清培养基是在基本合成培养基上加入起血清作用的各种激素和多肽生长因子如转铁蛋白，胰岛素，氢化可的松等动物培养基采用膜过滤法灭菌第四节 生产用动物细胞一、生产用动物细胞的获得（一）非基因工程细胞的获得1.原代细胞(primary cell)直接取自动物组织、器官，经过粉碎、消化而 获得的细胞悬液1g组织约有10
11、9个细胞增殖能力有限，需要大量的动物才能增加产量， 费钱费劳力, 限制了它的应用。动物细胞生产生物药品的早期，一般用原代培养 的细胞来生产疫苗，如鸡胚细胞、原代兔肾细胞 、鼠肾细胞、淋巴细胞等适合药物检测2.传代细胞系(passage cell)原代细胞经过传代、筛选、克隆，从多种细胞成 分的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的细 胞株(continuous cell lines, CCL)。染色体组型是2n的核型,二倍体细胞系具有贴壁依赖和接触抑制的特性有限的增殖能力，50代无致瘤性一般从胚胎中获得，有限传代WI-38, MRC-5, 2BS等。WI-38是第一个生产脊髓灰质炎灭活疫苗的二倍
12、体细胞系传代细胞在生物学特性上与肿瘤细胞有许多相似之 处, 有时是从肿瘤细胞衍生而来, 由于缺乏有效的科学手段来排除其潜在的致瘤性, 因而数十年间未 允许传代细胞用于生产。70年代以后，大量研究工 作证实了二倍体细胞的安全性现在CCL已被广泛用于人用治疗性药物的生产，但 仍不是理想的生产细胞系。3. 转化细胞系(transformant cell)l通过某个转化过程形成的，失去正常细胞的特点 。由于染色体的断裂变成异倍体，获得无限增殖 的能力自发的：正常细胞中自发的转化形成有无限生 命力的细胞系；多发生于啮齿类细胞动物人为转化：采用某些病毒SV40或某些化学试剂从动物肿瘤组织中建立的细胞系转化
13、细胞为永生化细胞，无限细胞系，连续细胞 系转化细胞具有无限生命力，倍增时间短，对培养 条件和生长因子等要求低，更适于大规模工业化 生产在生物制药中，可通过改造宿主细胞特性，如延 长细胞周期, 提高工程细胞原始表达水平等来提高药物的产量。Namalwa、CHO、BHK-21、Vero细胞。（二）基因工程细胞系的构建在生产中采用更多的、更有前景的是融合细胞，和采用基因工程手段构建的各种工程细胞基因工程细胞系：用基因工程技术或细胞融合技术 对宿主细胞的遗传物质进行修饰改造或重组，获得具有稳定遗传的独特性状的细胞系分杂种细胞(hybrid cell)和重组细胞 (reconstituted cell)
14、l（1）杂种细胞的构建：通过细胞融合技术构建的动物细胞融合：合并为双核和多核细胞的过程不同基因型的细胞融合为异核体 (heterokaryon)核体经有丝分裂和染色体重排，可形成具有新 的遗传性状的单核杂种细胞，合核体 (synkaryon)(1)细胞融合（cell fusion）：正常情况下，因有完整的细胞膜，两个接触的细 胞不发生融合诱导物可导致细胞融合：仙台病毒聚乙二醇物理方法：电击法，激光法仙台病毒融合法仙台病毒属于副黏病毒科，副流感病毒I型，RNA 病毒病毒表面有神经氨酸酶，降解细胞膜上的糖蛋白 ，使细胞粘在病毒周围，细胞互相渗透，融合目前很少使用聚乙二醇融合法PEG结构式：HOH2
15、C(CH2OCH2)nCH2OH分子量200-6，000常用分子量1000，浓度50%，pH8.0-8.2原理： 50%的PEG，与临近膜的水相结合，导致双 脂层的不稳定，使膜发生融合主要用于生产单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备电融合法细胞在短时间的强电场作用下，膜发生可逆性的 电击穿，使相邻细胞的膜发生继发性融合操作简便、无化学毒性、细胞损伤小、融合同步 、融合率高可比PEG高10-20倍可在显微镜下直接观察融合过程用于小鼠骨髓瘤细胞的融合，构建大量生产人源 单克隆抗体的淋巴杂交瘤细胞株还可用于真核细胞与原核细胞、动物细胞与植物 细胞的融合（2）杂种细胞筛选细胞融合后，除目的杂种细胞外，还有同合
16、体细 胞和未融合的亲本细胞筛选方法：（1）营养缺陷型细胞系或抗性细胞系作为融合 的亲本细胞，选择培养基来筛选（2）利用或人为制造两个亲本细胞的物理差异 ，如大小，密度等进行筛选（3）利用或人为制造杂种细胞与未融合细胞生 化或分生能力的差异，进行筛选2.重组细胞的构建（基因工程细胞系）在生产中采用更多的、更有前景的是融合细胞， 和采用基因工程手段构建的各种工程细胞包括CHO，BHK-21,SP2/0，Vero细胞等最多用的是CHO目前用重组DNA术改造的CHO细胞生产INF、IL、 EPO、单抗以及protein药品已成为国际医药市场 上的热销产品，但这些产品的生产规模普遍较小( 大多为5-50L的小型罐)（1） 表达载体的构建外源基因在动物细胞中高效表达，首先要将其构建在高效表达载体内，表
