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1、1. 欲从一种真菌中分离苹果酸脱氢酶，现将培养好的菌体加入缓冲液，通过超声波法破碎细胞，过滤得到 含酶的抽提液。假设已建立该酶活力测定的方法，请 设计一个硫酸铵分级沉淀获得该酶的方法，写出具体 步骤，并计算分级沉淀时硫酸铵的加入量。1) 20%饱和度硫酸铵沉淀取100 ml 酶抽提液置冰浴。根据硫酸铵饱和度表，查出应称取固体硫酸铵10.6g，每次缓慢加入少许硫酸铵，边加边搅拌，同时检测溶液pH值，如果pH呈酸性可加少量NaOH维持酶抽提液的pH值。置冰箱4 h，离心，沉淀置冰箱用于测酶活力，上清液测量体积。2) 30%饱和度硫酸铵沉淀假如上清液体积为98 ml，根据表计算称取固体硫 酸铵为5.
2、39g，其他操作同上。3) 40%-80%饱和度硫酸铵沉淀根据上清液体积计算称取固体硫酸铵量见下表上清液体积 硫酸铵饱和度 固体硫酸铵（g）95 40%5.3290 50%5.2285 60%5.180 70%4.96 75 80%4.884) 将不同饱和度获得的硫酸铵沉淀用少量缓冲液溶解 ，测酶活力。以不同饱和度硫酸铵为横坐标，酶活力 为纵坐标作图，见下图。0 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80%酶活力硫酸铵饱和度1020304050（酶活力单位 U/ml）5) 根据上图向酶抽提液加40%饱和度硫酸铵，置冰箱 过夜，离心，弃沉淀。上清液测量体积，继续加硫酸 铵使其饱和度达到
3、70%，置冰箱过夜，离心，收集沉 淀。2. 请根据下述稳态法推导的有序机制方程，自行设计虚拟数据，用作图法求出动力学常数Vm、Kia、KmB和KmA，写清楚每一步骤。固定底物B浓度，改变A的浓度，上式同除以B可得：把上式变成倒数方程：以1/对1/A作图，斜率为:纵轴截距为：横轴截距为：在不同固定B的浓度下以1/A对1/进行一次作图。12345-4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4B =0.5molB = 0.6 molB = 0.7 molB = 0.8 molB = 1.0 molB = 1.2 molB1/B纵截 (1/Vm)1.20.83 1.91.01 20.81.25 2.120
4、.71.42 2.30.61.67 2.750.52 4.220.51 1.5 2 2.50.511.522.53以一次作图中的1/B对纵轴截距作图：纵轴截距 =斜率为：KmB/Vm 纵轴截距为：1/Vm1/Vm =0.82 Vm =1.22 1.14 =KmB/Vm KmB =1.39B1/B斜率1.20.83 0.531.01 0.640.81.25 0.830.71.42 1.130.61.67 1.820.52 3.61 2 40.511.522.53以一次作图中的1/B对斜率作图：斜率 =斜率为：KiaKmB/Vm 纵轴截距为：KmA/Vm KmA/Vm =0.07 KmA=0.0851.27=KiaKmB/Vm Kia =1.143
