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1、半定量RT-PCR原理半定量RT-PCR是指通过总RNA逆转录为cDNA后，扩增目标cDNA和内参cDNA，通过PCR产物量推测样品中特异mRNA的相对数量。内参是基因组中保守的DNA序列，其表达恒定，因此在总RNA中所占的比例是大致恒定的。目标基因在受到处理因素影响后，其表达量一般有所改变。这样扩增后目标产物与内参产物量的比会有所变化，可以说明目标基因的表达量的改变，做到半定量！内参一般选用如：-actin（肌动蛋白），GAPDH（三磷酸甘油醛脱氢酶）等 步骤： 1.抽提RNA，2.反转录获得cDNA，3.以cDNA为模板做PCR 注意： 步骤1，RNA抽提质量一定要好，注意污染。内参的选择
2、，常用的有actin和GAPDH俩中。步骤3，半定量RT-PCR应该再两管中进行，既内参和目的基因各一管，这样便于控制，做图的时候可以放在一各泳道里跑！指数期和平台期一定要摸清楚！ 半定量RT-PCR步骤TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶 的35外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模 板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。 在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一 条探针。探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。 探针的5端标记有报告基团(Reporter, R)，如FAM、VIC等，3 端标记
3、有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如TAMRA等。当探针完 整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不 到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的 探针，其35外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭 基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号（图4）。所以，每经过 一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的 过程。信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。 TaqMan探针法TaqMan探针法TaqMan探针根据其3端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种：普通的TaqMan探针和TaqMan MGB探针。MGB探针的淬灭基团采用非
4、荧光淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher)，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有MGB (Minor Groove Binder)修饰基团（图5），可以将探针的Tm值提高10C左右。因此为了获得同样的Tm值，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高。因为在模板的DNA碱基组成不理想的情况下，短的探针比长的更容易设计。实验证明，TaqMan MGB探针对于富含A/T的模板可以区分得更为理想。 TaqMan探针法TaqMan探针法SYBR Green I荧光染料技术原理SYBR Green I是
5、一 种只与DNA双链结合的荧光染料（图6）。当它与DNA 双链结合时，发出荧光；从DNA双链上释放出来时，荧 光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表 了双链DNA分子的数量。SYBR Green荧光染料法定量 PCR的基本过程是：1、开始反应，当SYBR Green染 料与DNA双链结合时发出荧光。2、DNA变性时， SYBR Green染料释放出来，荧光急剧减少。3、在聚合 延伸过程中，引物退火并形成PCR产物。4、聚合完成后 ，SYBR Green染料与双链产物结合，定量PCR系统检 测到荧光的净增量加大。 SYBR Green I荧光染料技术SYBR Green I荧光染料技术SYBR Green I荧光染料能与所有的DNA双链相结合，对DNA模板没有选择性，所以特异性不如TaqMan探针。要想用荧光染料法得到比较好的定量结果，对PCR引物设计的特异性和PCR反应的质量要求就比较高。在此前提下，本法是一种成本低廉的选择。 常规PCR仪实时定量PCR仪
