补体参与的反应

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1、Part 补体参与的反应 Part T细胞数量及其功能检测实实 验验 三三免疫学教研室 王丽娜 Email：l 补体参与的反应补体的溶血反应- 免疫血清的制备与应用补体结合试验l T细胞及其功能检测E花环形成试验淋巴细胞转化试验：形态学方法3HTDR掺入法 MTT比色法T细胞亚群检测：间接免疫荧光法免疫组化法-SABCAP法补体激活的三条途径经典途径MBL途径旁路途径IC+C1qMBL+病原体配基细菌+C3膜攻击复合物细胞溶解Part 补体参与的反应思考题l材料：绵羊红细胞、补体、免疫血清（自 制）l问题：请设计实验检验你所制备的免疫血 清的特异性？1、补体的溶血反应-补体参与的反应l原理绵羊

2、红细胞（SRBC）作为抗原与其相应抗体（溶血素）结合后，通过经典途径激活补体，产 生膜攻击作用，最后导致红细胞溶解，发生溶血反应。 孔号 SRBC溶血素补体NS 13滴3滴3滴3滴 23滴3滴6滴 33滴3滴6滴43滴9滴结果 l 实验步骤及结果判断阴性阴性阳性溶血溶血不溶血反应系统指示系统溶血反应补体结合试验补体2、补体结合试验 -补体参与的反应原理12345 反应系统Ab Ag补体C NS摇匀，37C水浴，30mins指示系统溶血素 SRBC摇匀，37C水浴，30minsl 反应体系与结果判断结果溶血结果否 是是是否 羊红细 胞对照Part T细胞数量及其功能检测1. E花环形成试验l 原

3、理人外周血T细胞表面具有天然的能与绵羊红 细胞(SRBC)表面糖肽相结合的受体（E受体） ，可结合SRBC形成花环样细胞团。因为T细胞的异质性，它们对绵羊红细胞的 亲和力不同，所以T细胞可以形成不同类型的E花 环，如EtRFC （总花环） 、 EaRFC （活性花环 ）、 EsRFC （稳定性花环）等。 检测T细胞数量，间接判断机体的细胞免疫状况 。CD2l实验器材 肝素抗凝血、绵羊红细胞（SRBC） 淋巴细胞分层液、Hanks液、1640培养液、 0.5戊二醛固定液、灿烂甲酚兰染液 试管、滴管、离心机、微量移液器、玻片、 显微镜等l 实验步骤密度梯度离心法分离外周血单个核细胞：取稀 释好的人

4、外周血，用滴管贴管壁（倾斜30）轻 轻叠加于2ml分离液上（界面要清晰） 配平后 2000rpm离心 10mins。l离心后分为5层，由上8而下分别为：稀释的血浆、 单个核细胞、分离液、粒细胞、红细胞。1. 淋巴细胞悬液的制备：动作轻柔；分清滴管及枪头！稀释的血液 分层液离心前稀释的血浆 单个核细胞 分层液 粒细胞 红细胞 离心后 洗涤细胞：另取一支滴管，仔细吸出位于血浆 和分离液之间的乳白色的单个核细胞，放入盛 有5mlHanks液的试管2000rpm离心 5mins。弃上清（倾倒时液体不要回流），将沉 淀的淋巴细胞轻弹混匀后加入Hanks液5ml，重 复离心一次。2. 弃去上清，留经过洗涤

5、的淋巴细胞悬液0.1ml与 绵羊红细胞0.1ml 、1640营养液0.1ml混合 轻弹混匀后放于37温箱15mins。3. 取出试管，500rpm离心5mins。（注意此步 非常关键，转速一定要慢）室温静置3-5分钟 。 4. 取出试管，吸去半量上清液，轻轻旋转混匀 ，沿管壁滴加1滴戊二醛，轻轻混匀静置 5mins。5. 取25ul液体滴片，加一滴灿烂甲酚兰染液， 加盖玻片。 6. 显微镜下观察。E花环形成实验（灿烂甲酚兰染色，400）实验结果高倍镜下观察，计数100个淋巴细胞，计算花环形 成率。淋巴细胞上结合3个SRBC者为E花环阳性 。正常参考值：EtRFC：64.46.7；EaRFC：2

6、3.63.5；EsRFC：3.32.6l 实验结果2. 淋巴细胞转化试验 原理lT细胞在体外培养时，受到非特异性有丝分裂原( 如PHA、ConA)或特异性抗原刺激后，可出现代 谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加、细胞体积增大 并能进行分裂的淋巴母细胞，称淋巴细胞转化现 象。l淋巴细胞转化率的高低，可反映机体的细胞免疫 水平，故可作为测定机体免疫功能的指标。l常用方法 形态学方法 3H-TDR掺入法MTT比色法胞核的大小、与胞浆的比例、胞浆染色性、核的构造与 核仁的有无 成熟小淋巴细胞：核染色深、没有核仁，胞浆少 、染色为轻度嗜碱性； 淋巴母细胞：体积增大，形态不规则，核变大、 核质染色疏松，有核仁1

7、-2个，胞浆丰富，常出 现胞浆空泡； 其他细胞：中性粒细胞在培养72小时后，绝大部 分衰变或死亡呈碎片。(1)形态学方法-淋巴细胞转化试验 镜下结果红细胞未转化淋巴细胞转化的淋巴细胞淋巴细胞转化实验 瑞氏染色 10100 实验结果l淋巴细胞转化率转换的淋巴细胞 转换的淋巴细胞未转化的淋巴细胞100正常参考值：803H-TDR掺入法-淋巴细胞转化试验T细胞受到PHA或特异性抗原刺激后，发生有丝分裂，细胞进入S期，此时在细胞培养液中加入氚标记的胸腺嘧啶脱氧核苷（3H-TDR），可以被细胞摄入而掺入DNA中，通过-液体闪烁计数器测定3H-TDR的掺入量，判断细胞的增殖程度。 MTT比色法 -淋巴细胞

8、转化试验MTT为一种黄色可溶性物质，细胞活化增殖时通过线 粒体能量代谢，将MTT代谢成蓝紫色的甲臢，沉积于细胞内或细胞周围，形成甲臢的量与细胞活化增殖的 程度呈正比。甲臢经盐酸异丙醇溶解后呈紫蓝色，置 于酶标仪下根据显色程度即可知道甲臢量并反映细胞 活化程度。MTT Formazan Insoluble细胞上的CD分子相应鼠抗人单克隆抗体兔抗鼠 IgG荧光抗体反复洗涤，荧光显微镜下观察，计数阳性细胞。 间接免疫荧光法洗涤抗体荧光标记 抗Ig抗体 间 接 法3.T细胞亚群检测 间接SABC-AP法SABC：链霉亲合素生物素复合物AP：碱性磷酸酶生物素活化后可以标记抗体和酶，且不影响它 们的活性；

9、链霉亲合素同一定浓度的生物素、 酶混合后，就能形成链霉亲合素(SA)-生物素(B) -酶(E)复合物(SAB-EC)。这种复合物中至少存在 一个尚未被生物素占据的亲合素结合位点，可 与生物素标记抗体结合。 3.T细胞亚群检测 基本过程间接SABC-AP法 - T细胞亚群检测 CD分子T细胞一抗（小鼠抗人 CD3/CD4/CD8分子mAb）二抗（生物素化）SABC（标有AP）底物-AP-APAP -T细胞亚群检测（免疫组化，400） 补体参与的反应补体的溶血反应 补体结合试验 T细胞数量及其功能检测数量检测 E花环形成试验 T细胞亚群检测：间接免疫荧光 法免疫组化法-SABCAP 法功能检测 淋巴细胞转化试验：形态学方法 3HTDR掺入法 MTT比色法小结综合性实验免疫血清制备及应用不但要注意实验怎么做，还要知道该试验的用途。 溶血反应的原理、步骤、结果及分析。 E花环形成试验的原理、步骤（简单描述）、 绘制镜下观察结果并进行简单分析。 绘制淋巴细胞转化试验（形态学方法）、T亚 群检测的镜下观察结果。实 验 报 告通 知下次实验课随堂考核l方式：笔试（闭卷）和操作l范围：与所学（操作、示教）实验有关的原 理、结果及分析。